Comprehensive Approaches to Higher-Order Structure of Intact Proteins by Native Mass Spectrometry

Význam tématu

Native mass spectrometry umožňuje analýzu intaktních proteinů a jejich nekovalentních komplexů v přirozené konformaci při minimálním množství vzorku a krátkém čase analýzy

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této aplikace je popsat různé přístupy pro nativní MS intactních proteinů pomocí vysokorozlišovacích masových spektrometrů Agilent
Studie se zaměřuje na online a offline zásady výměny pufru, různé režimy infuze (nanoESI, kapilární tok, vysoký průtok, kapilární elektroforéza) a připojení iontové mobility pro studium vyššího řádu struktury

Použitá metodika

Offline výměna pufru se provádí na Micro Bio-Spin 6 kolonkách do 100 mM amoniakálně acetátového pufru, pH 7
Online odsolování se provádí pomocí SEC kolon (PolyHYDROXYETHYL A nebo AdvanceBio SEC guard) s isokratickým elucí v 100–200 mM amoniakálně acetátovém pufru, pH 7
Kapilární elektroforéza používá PVA kapiláru s isokratickým pumpovacím systémem a vhodným background elektrolytem (0,1 % kyselina octová pro denaturaci, 25 mM amoniakálně acetát pro native MS)

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II LC systém (binary pump, multisampler, termostatovaná kolona) s kapilárním nebo standardním nástřikem
• Agilent 7100 kapilární elektroforéza se sadou CE/MS a CE-ESI sprayer
• Agilent 6200, 6500 Series MS a 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF pro vysokomassový SWARM autotune
• Agilent 6560 Ion Mobility LC/Q-TOF pro studium konformačních změn a CIU
• Ovládací a datová analýza v MassHunter Acquisition, Qualitative Analysis, BioConfirm a UniDec

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace zdrojových podmínek (teplota 150 °C, průtok plynu 11 L/min, tlak 35 psi) udržela hexamer GDH intaktní a minimalizovala disociaci
Optimalizace parametrů oplachového plynu u ADH na 6545XT zvýšila citlivost o 50 % ve srovnání se standardním režimem
Rozšířený rozsah hmotnosti do m/z 30 000 se SWARM autotune umožnil analýzu komplexů až do 801 kDa (GroEL 14-mer) a MS/MS fragmentaci pro uvolnění podjednotky
CE/MS ukázala rozdíly mezi denaturujícím (kyselina octová) a nativním (amoniakálně acetát) režimem analýzy IgG1
IM-MS na 6560 umožnila studium kolizí indukovaného skládání/rozkládání ubiquitinu při různých napětích v pastičce
Data dekonvoluce a analýzy struktur uskutečněné v UniDec ukázaly přesné hmotnosti proteinů a umožnily hodnocení homogenity

Přínosy a praktické využití metody

• Robustní workflow pro charakterizaci mAb, ADC a nekovalentních komplexů ve farmaceutickém prostředí
• Vysoká citlivost a nízký požadavek na množství vzorku vhodné pro PKDM a výzkum
• Možnost sledování posttranslačních modifikací a konformačních stavů proteinů v nativních podmínkách
• Flexibilita režimů infuze a podpůrných separačních technik pro různé typy vzorků

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace iontové mobility s nativní MS pro štěpení složitých směsí a studium dynamických změn struktury
Vývoj nových autotune algoritmů a vysoko-massových detektorů pro ještě vyšší rozsahy a rozlišení
Automatizace online výměny pufru a kombinace s dalšími separačními technikami (UHPLC, mikrofluidika)
Využití strojového učení pro rychlou analýzu a interpretaci komplexních dat nativní MS a IM-MS

Závěr

Agilent 6500 Series Q-TOF nabízejí robustní platformu pro nativní analýzu intaktních proteinů a nekovalentních komplexů
Volba infuze (nanoESI, mikroprůtok, vysoký průtok, CE) a online/offline odsolování umožňuje široké aplikace od výzkumu po QA/QC
Rozšířený hmotnostní rozsah a IM-MS rozšiřují možnosti studia vyššího řádu struktury a konformací proteinů

Reference

1. Valliere-Douglass J F McFee W A Salas-Solano O Native Intact Mass Determination of Antibodies Conjugated with Monomethyl Auristatin E and F at Interchain Cysteine Residues Anal Chem 2012 84(6) 2843–2849
2. Freeke J Robinson C V Ruotolo B T Residual Counter Ions Can Stabilise a Large Protein Complex in the Gas Phase Int J Mass Spec 2010 298(1) 91–98
3. Campuzano I Giles K Nanospray Ion Mobility Mass Spectrometry of Selected High Mass Species In Nanoproteomics Methods and Protocols 2011 57–70
4. Marty M T et al Bayesian Deconvolution of Mass and Ion Mobility Spectra From Binary Interactions to Polydisperse Ensembles Anal Chem 2015 87(8) 4370–4376