Characterization of Viral Vector Particles Using the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF

Význam tématu

Adeno-asociované viry (AAV) představují klíčové vektory pro cílené podání genové terapie, zejména u očních onemocnění a spinální muskulární atrofie. Charakterizace kritických kvalitativních atributů (CQAs) intactních virových částic a jejich potranslačních modifikací (PTM) je zásadní pro zabezpečení kvality, bezpečnosti a účinnosti finálních terapeutik.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo vyvinout a demonstrovat robustní workflow pro simultánní analýzu intactních AAV8 částic a mapování peptidů jejich kapsidových proteinů (VP1, VP2, VP3). Studie se zaměřila na stanovení přesné hmotnosti proteoform (včetně fosforylací a acetylací) a na dosažení vysoké sekvenční pokrytí s lokalizací PTM.

Použitá metodika

Workflow zahrnovalo přípravu vzorku formou vícenásobné výměny pufru (TCEP, 80 % voda/20 % acetonitril, 0,1 % kyselina mravenčí) pro intactní analýzu a standardní denaturaci, redukci, alkylaci a digesci enzymy trypsinem a rAsp-N pro peptide mapping. LC/MS rozdělení zahrnovalo gradientní eluční metody pro oba režimy. Iterativní MS/MS sběr umožnil detekci i nízkoodběrných peptidů a potvrzení PTM s chybou hmotnostního měření pod 10 ppm.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II LC (high-speed pump G7120A, multisampler G7167B, column compartment G7116B)
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s duálním Agilent Jet Stream zdrojem
• MassHunter Acquisition B.09.00 a BioConfirm 10.0 software
• Sloupce: ZORBAX RRHD 300-Diphenyl (2.1×150 mm, 1.8 µm) pro intact; AdvanceBio Peptide Mapping (2.1×150 mm) pro peptide mapping

Hlavní výsledky a diskuse

Intactní analýza odhalila tři fosforylační formy VP1 a VP2 s přesností 4–6 ppm a acetylované formy VP3 (70 % acetylace). Příprava pufru významně zlepšila intenzitu signálu (~1,5×) a omezila addukty sodíku a draslíku. Peptidové mapování vykázalo sekvenční pokrytí 97,7 % (VP1), 98,5 % (VP2) a 100 % (VP3). Fosforylace a N-terminální acetylace lokalizované MS/MS potvrdily stabilitu a kvalitu kapsidových proteinů. Nízká hladina oxidačních či deamidačních modifikací (<2 %) odpovídá očekávané stabilitě.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený postup poskytuje vysokou citlivost a přesnost při monitorování rozličných proteoform, usnadňuje udržení CQAs během vývoje a výroby genových terapií a splňuje požadavky regulačních orgánů na charakterizaci bílkovinné složky léčiv.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření automatizace přípravy vzorku a integrace do vysoko-propustných QC linek. Další výzvy zahrnují kvantifikaci glykosylací, rozšíření na další serotypy a vektory, a multimodální kombinaci MS s ortogonálními technikami pro komplexní profilování.

Závěr

Agilent 1290 Infinity II LC ve spojení s 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF a BioConfirm 10.0 tvoří robustní řešení pro přesnou hmotnostní analýzu a identifikaci PTM AAV kapsidových proteinů. Workflow nabízí vysokou citlivost, přesnost pod 10 ppm a sekvenční pokrytí přes 97 %, což napomáhá zajištění kvality genových terapií.

Reference

• Dalkara D. et al. Sci. Transl. Med. 2013, 5(189):189ra76.
• Xie Q. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002, 99(16):10405–10410.
• Wu Z., Asokan A., Samulski R.J. Mol. Ther. 2006, 14(3):316–327.
• Bui H. et al. ASMS Poster WP-681 (2014).
• Jin X. et al. Hum. Gene Ther. Methods 2017, 28(5):255–267.
• Giles A.R. et al. Mol. Ther. 2018, 26(12):2848–2862.
• Van Vliet K. et al. J. Virol. Methods 2009, 159(2):167–177.
• Arruda V.R. et al. J. Thromb. Haemost. 2007, 5(1):12–15.
• FDA CMC Information for Human Gene Therapy INDs, 2020.