Purity and Identity Characterization of Adeno-Associated Virus Capsid Particles by Intact and Bottom-Up Based Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Methods

Význam tématu

Adeno-asociované viry (AAV) představují klíčový vektor pro cílenou genovou terapii. Jejich proteinový obal zabezpečuje ochranu genetického materiálu a umožňuje specifickou transdukci cílových buněk.

Precizní stanovení čistoty a identity (critical quality attributes, CQA) virových kapsid je klíčové pro bezpečnost a účinnost léčivých přípravků. Metody hmotnostní spektrometrie překonávají omezení konvenčních technik a poskytují vysokou citlivost a přesnost při analýze AAV.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentované studie bylo vyhodnotit kombinovaný přístup intaktní LC–MS a bottom-up peptidového mapování pro charakterizaci AAV8 kapsidových proteinů. Hlavní body studie zahrnují:

• Identifikaci a kvantifikaci proteoform s post-translačními modifikacemi (PTM).
• Analýzu sekvenčního pokrytí proteinů VP1, VP2 a VP3 pomocí peptidového mapování.

Použitá metodika

Analytické kroky zahrnovaly:

• Intaktní analýzu: výměnu pufru pomocí 10 kDa filtrů, použití 5 mM TCEP, 20 % H₂O, 80 % acetonitrilu a 0,1 % kyseliny mravenčí.
• Peptidové mapování: denaturaci, redukci, alkylaci a enzymatické štěpení trypsinem a proteázou rAsp-N.

Použitá instrumentace

• Kapalinová chromatografie: Agilent 1290 Infinity II LC.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s dual Jet Stream zdrojem.
• Sloupce: Zorbax RRHD Diphenyl 2.1×150 mm, 2.7 µm pro intaktní analýzu; AdvanceBio Peptide Mapping 2.1×150 mm, 1.8 µm pro peptidové mapování.
• Podmínky: teplota sloupce 60 °C, průtok 0.4 mL/min, injekce 20–40 µL.
• Software: MassHunter Acquisition (B.09.00) se SWARM autotune; BioConfirm 10.0 pro dekonvoluci a peptidovou identifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktní analýza odhalila chromatografické oddělení VP1–VP3 s vysokou hmotnostní přesností <10 ppm. Na VP1 byly lokalizovány tři fosforylační místa, na VP2 nejméně dvě a u VP3 bylo zjištěno N-terminální acetylování v ~70 % formě.

Peptidové mapování dosáhlo sekvenčního pokrytí 97.7–100 % pro všechny kapsidové proteiny. Iterativní MS/MS workflow umožnilo detekci nízce zastoupených peptidů a lokalizaci PTM, včetně fosforylace, deamidace a oxidace.

Přínosy a praktické využití metody

• Detailní charakterizace struktury AAV kapsid s rozlišením proteoform.
• Přesná kvantifikace post-translačních modifikací a jejich lokalizace.
• Splnění regulačních požadavků na strukturu a čistotu genových terapií.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace a standardizace workflow pro vysokopropustné QC laboratoře.
• Rozšíření enzymatických přístupů pro ještě vyšší sekvenční pokrytí.
• Integrace pokročilých dekonvolučních algoritmů a strojového učení pro analýzu komplexních spekter.

Závěr

Kombinace intaktní LC–MS a bottom-up peptidového mapování poskytuje komplexní a spolehlivou metodiku pro hodnocení kvality AAV8 kapsid. Studie potvrdila vysokou přesnost, rozsáhlé sekvenční pokrytí a schopnost lokalizovat klíčové PTM, což podporuje implementaci těchto metod v biotechnologickém vývoji a kontrole kvality.

Reference

1. Dalkara D. et al. Sci. Transl. Med. 2013, 5(189), 189ra76–189ra76.
2. Moore NA. et al. Expert Opin. Biol. Ther. 2018, 18(1), 37–49.
3. Wu Z. et al. Mol. Ther. 2006, 14(3), 316–327.
4. Jin X. et al. Hum. Gene Ther. Methods 2017, 28(5), 255–267.
5. Giles AR. et al. Mol. Ther. 2018, 26(12), 2848–2862.