High-Throughput Determination of Thiamine in Whole Blood and Erythrocytes

Význam tématu

Nedostatek thiaminu (vitaminu B1) je závažný zdravotní problém, zejména v populacích preferujících rafinovanou bílou rýži. Biochemicky aktivní forma thiaminu, thiamin-difosfát (TDP), je klíčová pro energetický metabolismus a centrální enzymatické reakce. Přesné a vysoce propustné stanovení TDP v krvi a erytrocytech umožňuje spolehlivou diagnostiku deficitu a podporuje veřejné zdravotní studie na populační úrovni.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a validovat ultrarychlou kolonu UHPLC-FLD metodu s online precolumn derivatizací pro kvantifikaci thiaminu (TDP) v celkové krvi a erytrocytech. Metoda byla optimalizována pro vysokou propustnost, minimalizaci degradace derivátů a vysokou opakovatelnost. Aplikace na 1487 reprezentativních vzorcích kambodžských žen a dětí prokázala její praktickou využitelnost v rozsáhlém klinickém šetření.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorku: precipitace bílkovin 10 % trichloroctovou kyselinou, extrakce MTBE, odstranění TCA, naředění vodou.
• Online derivatizace: automatické promíchání vzorku s činidly (K3Fe(CN)6 v NaOH a methanolem) v injektoru těsně před chromatografií.
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity LC, ZORBAX Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HT (3,0 × 50 mm, 1,8 µm), gradientní eluce v pufru fosforečnanu sodného/methanolu.
• Detekce: fluorescenční detektor (Ex 375 nm, Em 435 nm).
• Software: OpenLab CDS ChemStation Edition C.01.05.

Hlavní výsledky a diskuse

• Limit detekce (LOD) 10,0 nmol/L, limit kvantifikace (LOQ) 30,2 nmol/L.
• Lineární oblast 32,9–263,6 nmol/L s koeficientem determinace R2 ≥ 0,9978.
• Obnova 95–106 %, přesnost RSD < 4 %.
• Výrazně lepší stabilita derivátů (min. 72 h při 4 °C) oproti offline derivatizaci (< 16 h).
• Analýza 1487 vzorků potvrdila praktickou využitelnost a propustnost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé a spolehlivé stanovení TDP ve velkém objemu vzorků, minimalizuje riziko degradace a chyb při manuální přípravě. Díky automatizaci je vhodná pro klinické laboratoře, populační screening a výzkumné programy zaměřené na nutriční deficity.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro rozšíření třídy vitamínů a metabolitů.
• Další miniaturizace a mikrofluidní platformy pro bodové testy.
• Automatizované systémy pro longitudinální monitoring nutričního stavu.
• Využití v environmentální a potravinářské analytice pro kontrolu doplňků stravy.

Závěr

Vyvinutá UHPLC-FLD metoda s online precolumn derivatizací poskytuje vysokou propustnost, opakovatelnost a citlivost pro stanovení thiaminu v krvi a erytrocytech. Validace prokázala vynikající analytické parametry a metoda byla úspěšně aplikována na rozsáhlou populační studii. Tento přístup je perspektivní pro klinické a výzkumné laboratoře zaměřené na výživu a metabolismus.

Reference

1. Lonsdale D. A Review of the Biochemistry, Metabolism and Clinical Benefits of Thiamin(e) and its Derivatives. eCAM 2006, 3, 49–59. DOI: 10.1093/ecam/nek009.
2. Soukaloun D et al. Erythrocyte Transketolase Activity, Markers of Cardiac Dysfunction and the Diagnosis of Infantile Beriberi. PLoS Negl Trop Dis. 2011, 5. DOI: 10.1371/journal.pntd.0000971.
3. Ross AC et al. Modern Nutrition in Health and Disease: Eleventh edition. Wolters Kluwer Health Adis, 2012.
4. Anderson W. Beriberi, White Rice, and Vitamin B: A Disease, a Cause, and a Cure. Q Rev Biol. 2002, 77, 367–368. DOI: 10.1086/345272.
5. Coats D et al. Thiamine Deficiency in Cambodian Infants with and without Beriberi. J Pediatr. 2012, 161, 843–847. DOI: 10.1016/j.jpeds.2012.05.006.
6. Gibson RS. Principles of Nutritional Assessment, 2nd ed. Oxford University Press, 2005.
7. Talwar D et al. Vitamin B1 Status Assessed by Direct Measurement of Thiamin Pyrophosphate in Erythrocytes or Whole Blood by HPLC. Clin Chem. 2000, 46, 704–710. DOI: 10.1373/clinchem.2007.099077.
8. Lu J, Frank EL. Rapid HPLC Measurement of Thiamine and its Phosphate Esters in Whole Blood. Clin Chem. 2008, 54, 901–906. DOI: 10.1373/clinchem.2007.099077.
9. Whitfield KC et al. High Prevalence of Thiamine (Vitamin B1) Deficiency in Early Childhood among a Nationally Representative Sample of Cambodian Women of Childbearing Age and Their Children. PLoS Negl Trop Dis. 2017, 11. DOI: 10.1371/journal.pntd.0005814.