Validation of a new fully automated assay of Thiamine-PyroPhosphate and Pyridoxal-5’-Phosphate in whole blood using LC-MS/MS

Význam tématu

Thiamine-PyroPhosphate (TPP) a Pyridoxal-5’-Phosphate (PLP) jsou biologicky aktivní formy vitamínů B1 a B6 nezbytné pro energetický metabolismus a řadu enzymových reakcí. Nedostatek těchto koenzymů může vést k závažným klinickým stavům, zejména u pacientů s malnutricí, onkologickou léčbou či jaterními a renálními poruchami. Rychlé zpracování vzorků a přesná kvantifikace pomocí plně automatizovaného LC-MS/MS přístupu odpovídá rostoucímu objemu vyšetření v klinických laboratořích.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat jednoduchou, rychlou a plně automatizovanou UHPLC-MS/MS metodu pro současné stanovení TPP a PLP v celém krevním vzorku s minimální přípravou, která sníží riziko laboratorních chyb a zrychlí výsledkový proces.

Použitá metodika a instrumentace

Systém připravený pro analýzu zahrnoval:

• Automatizovanou přípravu vzorku pomocí modulu CLAM-2030 (Shimadzu) s on-line extrakcí, precipitací bílkovin a filtrací.
• IVD certifikovaný kit Diagnotix přizpůsobený pro objemy na automatu.
• Chromatografii na UHPLC Nexera X3 se sloupcem XBridge BEH C18 (3,0 × 75 mm, 30 °C), mobilní fáze A (vodná) a B (organická), průtok 0,6 mL/min, injekční objem 20 µL.
• Detekci na trojčtvrťovém hmotnostním spektrometru LCMS-8050 s ESI+, ultra rychlým MRM režimem (až 555 přechodů/s) a polaritním přepínáním 5 ms.

Hlavní výsledky a diskuse

Linearita obou analyzů byla prokázána v relevantních koncentracích (TPP 12–341 nmol/L, PLP 17–1592 nmol/L) s korelačními koeficienty r2 > 0,999. Preciznost a přesnost (inter- i intra-assay) splňovaly klinické požadavky: CV obvykle pod 5 % a bias v rozsahu ±3 %. Porovnání manuální a automatické přípravy pomocí Passing-Bablokovy regresní analýzy prokázalo vynikající shodu. Chromatogramy pacientských vzorků vykázaly dostatečné rozlišení a citlivost pro běžné monitorovací koncentrace.

Přínosy a praktické využití metody

Plně automatizovaný workflow eliminuje manuální kroky, zkracuje dobu přípravy, minimalizuje chyby a zvyšuje denní průtok vzorků. Metoda je vhodná pro rutinní klinické laboratoře, výzkumné pracoviště i QA/QC v potravinářství či farmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace s laboratorními informačními systémy (LIS), rozšíření panelu vitamínů či metabolitů, miniaturizace spotřeby reagencií a přechod k vysokopropustným screeningům jsou klíčovými směry dalšího rozvoje. Potenciál mají také aplikace v bodové péči (point-of-care) a terénních studiích.

Závěr

Přijatá metoda plně automatizované UHPLC-MS/MS analýzy TPP a PLP v celém krvi splňuje přísné požadavky na linearitu, preciznost i přesnost. Díky robustnímu a časově úspornému přístupu se jeví jako ideální nástroj pro klinické i výzkumné aplikace.

Reference

1. Vuurpijl J, van den Heuvel D, Wilbers C, Stokhof de Jong T, Hoedemakers R. Validation of a new fully automated assay of Thiamine-PyroPhosphate and Pyridoxal-5’-Phosphate in whole blood using LC-MS/MS. Jeroen Bosch Ziekenhuis; Shimadzu Benelux.