Impurity Profiling of GLP-1 Receptor Agonists by HILIC-MS

Význam tématu

Profilování nečistot v (bio)synthotických GLP-1 receptorových agonistech je klíčové pro zajištění kvality, bezpečnosti a účinnosti léčivých peptidů určených k léčbě cukrovky 2. typu a obezity. Regulace doprovodných produktů vznikajících při syntéze, degradaci či skladování peptideů vyžaduje spolehlivé analytické metody schopné rozlišit strukturálně podobné a nízce koncentrované látky.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo představit vodorozpustnou chromatografii na principu hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) v kombinaci s biokompatibilními LC komponentami a single quadrupole MS jako ortogonální doplněk klasického RPLC pro analýzu nečistot Exenatidu, Semaglutidu a Tirzepatidu. Metoda měla prokázat schopnost rozlišit a identifikovat hlavní látky i produktově spojené nečistoty na úrovních <1 %.

Použitá metodika a instrumentace

Monofázová HILIC metoda využívá deaktivovaný nerezový sloupek 2,1×150 mm, 2,7 µm HILIC-Z a biokompatibilní LC systém Agilent 1290 Infinity III Bio. Mobilní fáze A obsahuje 100 mM amonného formiátu pH 3 a B acetonitril. Gradient od 90 % B na 45 % B během 19 min při 0,4 mL/min a teplotě 40 °C. Detekce DAD (280 nm) a single quadrupole MS (ESI+, m/z 500–1450). Celý tokový systém minimalizuje kovové interakce adsorpce analyzátů.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila rozlišit a hmotnostně potvrdit hlavní peptidy a více než deset nízce abundantních nečistot:

• Tirzepatid: detekována nečistota s +163 Da (přidání tyrosinu) na hladině ~1,1 %.
• Semaglutid: tři nečistoty na 0,2–0,4 % úrovních – stereoisomerizace, cyklizace N-terminální histidinové zbytky (+12 Da) a cílená truncace [3-31] (–222 Da).
• Exenatid: oxidace methioninu (+16 Da) se dvěma diastereomery, přidání glycinu (+57 Da), přidání Leu/Ile (+113 Da) a N-terminální zkrácení histidin-Aib (–137 Da).

Single quadrupole MS potvrdil identitu všech sledovaných nečistot podle nabíjených stavů a přesné hmotnosti. HILIC selektivita doplnila RPLC a umožnila lepší rozlišení stereoisomerů a lipidově modifikovaných forem.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Ortogonální selektivitu k RPLC pro komplexní profilování peptidů.
• Biokompatibilní hardware minimalizující adsorpci peptidů na kovových površích.
• Rychlou a robustní analýzu s přímým připojením na MS pro jednoznačnou identifikaci.
• Schopnost detekovat a kvantifikovat nečistoty na úrovních regulovaných mezí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj metod by mohl zahrnovat dvourozměrnou LC (HILIC×RPLC) pro ještě vyšší rozlišovací schopnost, širší aplikaci na různé struktury peptidů a konjugátů, nasazení vysoce výkonných hmotnostních analyzátorů (Q-TOF, orbitrap) a automatizované softwarové nástroje pro hloubkovou charakterizaci nečistot.

Závěr

Prezentovaná HILIC-MS metoda s biokompatibilními komponentami poskytuje spolehlivý a ortogonální přístup k profilování nečistot GLP-1 receptorových agonistů. Umožňuje rychlou separaci, detekci a hmotnostní potvrzení nízce abundantních peptidových nečistot a výrazně doplňuje standardní RPLC metodiky v oblasti QC a vývoje léčiv.

Reference

• Yu M. et al. Adv. Drug Deliv. Rev. 2018, 130, 113–130.
• D’Hondt M. et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 101, 2–30.
• Alvarez P. et al. Agilent AN 5994-8308EN, 2025.
• McCalley D. V. J. Chromatogr. A 2017, 1523, 49–71.
• Guimaraes G. J.; Bartlett M. G. Anal. Chim. Acta 2023, 1250, 340994.
• EMA draft guideline EMA/CHMP/CVMP/QWP/387541/2023.