Definitive Protein Sequencing by Top-Down MS with timsOmni and OmniScape

Definitivní sekvenování proteinu metodou top-down MS na platformě timsOmni s analýzou v OmniScape

Význam tématu

Proteomika založená na bottom-up přístupu je široce používaná, ale spoléhá se na rozštěpení proteinů na peptidy a následnou inferenci proteinové sekvence; to může vést k chybným či neúplným přiřazením zejména v případech sekvenčního zamíchání, nedostupných oblastí pro proteolýzu nebo nečekaných modifikací. Top-down hmotnostní spektrometrie analyzuje intaktní proteoformy a zachovává informace o pořadí aminokyselin a vzájemných vztazích lokálních modifikací. Při úplné rekonstrukci sekvencí však brání omezená dostupnost specializovaného softwaru a složitost spekter. Studie ukazuje praktické využití kombinace vyspělé instrumentace (timsOmni) a dedikovaných pracovních postupů v OmniScape pro de novo rekonstrukci a korekci chybné BU sekvence, což má význam pro přesnou identifikaci proteoform a validaci biotechnologických produktů a biologických výzkumných vzorků.

Cíle a přehled studie / článku

• Cílem bylo znovu ověřit a definitivně stanovit sekvenci proteinu, jehož sekvence byla původně odvozena z bottom-up dat, pomocí top-down experimentů provedených na platformě timsOmni a zpracovaných v OmniScape.
• Studie aplikovala vícestupňový přístup: de novo analýzu, clipping (ořezání) C-terminu, screening substitucí a potvrzovací workflowy napříč různými fragmentačními režimy až k dosažení 100% pokrytí sekvence.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: přibližně 9 kDa protein. Příprava: dialýza proti vodě, lyofilizace a následné rozpuštění při koncentraci 4 µM v roztoku H2O:ACN:FA (50:49.5:0.5).
• Instrumentace: Bruker timsOmni platforma s Apollo II zdrojem, průtok 3 µL/min, analýza offline.
• MS nastavení: primární prekursor ve stavu 8+; provedeny MS2 experimenty využívající vícero fragmentačních režimů: CID, RCID, ECD, ECciD, EID a kombinované režimy; zpracování dat a de novo/PTM workflowy v OmniScape (včetně Single-site Substitution Screening, PTM Screening a Clipping Analysis).

Hlavní výsledky a diskuse

• Rozdíl mezi hmotností změřenou top-down MS a hmotností předpovězenou z BU dat indikoval, že původní BU-derived sekvence byla chybná nebo přebytečně dlouhá.
• De novo analýza MS2 dat v režimu ECD identifikovala N-terminální His-tag a molekulární posun odpovídající sekvenci MHH, což poukázalo na nesprávné přiřazení první části sekvence v BU návrhu.
• Postupné revize sekvence: první revize přinesla plné N-terminální pokrytí až do pozice 45, ale teoretická hmotnost byla stále větší než naměřená; druhá revize zlepšila pokrytí konců, ale odhalila mezeru mezi pozicemi ~45–59; clipping analysis systematicky ořezal nadbytečný C-terminus a zkrátil sekvenci na správnou délku.
• PTM Screening a Single-site Substitution Screening určili, že residua na pozicích 45 a 59 (označená v původním návrhu jako O45 a O59) jsou ve skutečnosti glutamin (Q), čímž byly provedeny cílené amino-kyselinové substituce v sekvenci.
• Konečná, třetí sekvenční revize byla potvrzena napříč fragmentačními módy; zejména data z ECciD poskytla SC=100 % (plné pokrytí sekvence). Potvrzení proběhlo i pomocí CID, EID a ECciD dat, čímž byla finální sekvence validována.
• Výsledkem byla korekce původního BU odhadu: potvrzení His-tagu na N-terminu, identifikace 12-aminokyslinného úseku na N-terminu získaného de novo, oprava přebytečného C-terminu a dvě cílené substituce (45 a 59 → Q).

Přínosy a praktické využití metody

• Top-down workflow s podporou dedikovaného softwaru umožnil definitivní určení proteové sekvence tam, kde bottom-up přístup selhal nebo poskytl mylné informace.
• Platforma timsOmni v kombinaci s rozmanitými fragmentačními režimy poskytuje bohatá a komplementární MS2 data, která zvyšují důvěryhodnost de novo návrhů.
• Prakticky je tento přístup vhodný pro validaci rekombinantních proteinů (např. potvrzení přítomnosti N‑terminálních tagů), pro přesné určení proteoform a pro detekci a lokalizaci irelevantních či nesprávně přiřazených oblastí v sekvenci.
• Metoda je užitečná v kontextech kvality bioproduktů, vývoje biologických léčiv, a výzkumu PTM a proteoform diverzity.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Očekává se širší adopce top-down přístupů v rutinních laboratořích s pokračujícím vývojem uživatelsky přívětivého softwaru pro de novo sekvenování a integraci pracovních postupů (např. automatizované clipping a substitution screening).
• Zefektivnění kombinace iontové mobility, vysokorozlišovací MS a více fragmentačních režimů zvýší schopnost rozlišit izobarické residua a složité PTM konstelace.
• Vylepšení algoritmů pro interpretaci spekter, strojové učení a databázové přístupy by mohly urychlit rekonstrukci sekvencí a snížit potřebu manuálního zásahu.
• Možnosti rozšíření: vysokopropustné workflowy pro screening proteomů, aplikace v metrologii biologických produktů a standardizace postupů pro regulační účely.

Závěr

Top-down analýza na timsOmni společně s OmniScape de novo a PTM/substitution workflowy umožnila korekci a definitivní stanovení sekvence proteinu, která byla dříve mylně odvozena bottom-up přístupem. Postup zahrnoval identifikaci N‑terminálního His-tagu, de novo přidání 12-aminokyslinného úseku, korekci C-terminální nadměrné délky a lokalizaci dvou substitucí (pozice 45 a 59 → Q). Finální sekvence byla potvrzena napříč fragmentačními módy s 100% pokrytím sekvence, což demonstruje schopnost top-down metod poskytovat přesnou a úplnou rekonstrukci proteoformy v případech, kde bottom-up analýza selhává.

Reference

1. Bensaddek D., Diaz Galicia M.E., Rueping M., Kosmopoulou M., Smyrnakis A., Alevizos G., Papanastasiou D., Amad M. Definitive Protein Sequencing by Top-Down MS with timsOmni and OmniScape. ASMS 2026, Poster WP662. King Abdullah University of Science and Technology (KAUST) & Fasmatech/Bruker, 2026.