In-Depth Protein Sequence Verification by TIMS-enabled MALDI Top-Down Sequencing

Význam tématu

TIMS-enabled MALDI top-down sekvenování kombinuje iontově-mobilní separaci (TIMS) s in-source decay (ISD) pro detailní analýzu proteomů. Tento přístup umožňuje vysoké sekvenční pokrytí a přesnou verifikaci polypeptidových řetězců, což je klíčové pro charakterizaci bioterapeutik, kontrolu kvality a výzkum struktury proteinů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo otestovat kombinaci MALDI-ISD, TIMS a T³-Sequencing na subjednotkách referenční monoklonální protilátky NISTmAb. Autoři si dali za úkol:

• Ověřit sekvenční pokrytí (SC) blízké 100 % pro Fd, Fc/2 a LC.
• Porovnat využití 1+ a 2+ fragmentačních iontů separovaných TIMS.
• Demonstraci efektivity de novo analýzy pomocí softwaru OmniScape a homology search (MS-BLAST, Novor).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky bovinní karboanhydrázy II a NISTmAb 8671 byly redukovány na subjednotky Fd, Fc/2 a lehký řetězec. Po LC separaci byly vzorky zaseknuty v matrici sDHB a analyzovány na přístroji timsTOF fleX s červeným fosforem jako kalibrantem. Proces zahrnoval:

• MALDI-ISD se záznamem 1+ a 2+ iontových sérií.
• Separaci iontů na základě mobility v TIMS.
• T³-Sequencing pro selektivní sekvenování blízkých terminálním fragmentům.
• Předzpracování dat v softwaru DataAnalysis 6.1.
• Vyhodnocení dat v OmniScape s následným vyhledáním v MS-BLAST a NovorTag lokální databáze SWISSPROT s přidanou NISTmAb sekvencí.

Použitá instrumentace

• timsTOF fleX (Bruker) s MALDI-ISD a TIMS modulem
• Softwarové balíčky DataAnalysis 6.1, OmniScapeTM
• Online MS-BLAST a Rapid NovorTag pro de novo a homology vyhledávání

Hlavní výsledky a diskuse

Studie dosáhla téměř 100% sekvenčního pokrytí všech tří subjednotek NISTmAb. Klíčové poznatky:

• TIMS separace 1+ a 2+ fragmentů výrazně zvyšuje pokrytí oblastí s nízkou hojností iontů (např. CDR3).
• Kombinace MALDI-ISD-TIMS a T³-Sequencing přinesla u Fc/2, Fd a LC pokrytí blízké 99 % SC.
• Offline LC-MALDI umožňuje nezávislou optimalizaci separace a akvizice, což vede k vysoké hmotnostní přesnosti a věrnosti izotopického vzoru.
• De novo tagy a homology vyhledávání v NISTmAb+SWISSPROT databázi potvrdily identitu subjednotek i variabilních oblastí CDR.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlou a spolehlivou verifikaci sekvence bioterapeutik včetně variabilních oblastí protilátek.
• Přesnou identifikaci proteoform a posttranslačních modifikací.
• Možnost nasazení v QA/QC laboratořích farmaprodukce.
• De novo sekvenování u vzorků bez předchozí sekvenční referenční databáze.

Budoucí trendy a možnosti využití

Předpokládaný rozvoj zahrnuje:

• Integraci vyšších úrovní MSn pro komplexnější strukturální sondáž.
• Automatizaci zpracování dat a rozšíření knihoven proteomických dat.
• Aplikaci na obtížně analyzovatelné proteiny, glykoproteiny a komplexy.
• Implementaci do klinické proteomiky a personalizované medicíny.

Závěr

Kombinace MALDI-ISD, TIMS a T³-Sequencing v top-down proteomice poskytuje výjimečné sekvenční pokrytí a spolehlivou de novo analýzu. Metoda představuje významný pokrok v charakterizaci komplexních proteinových vzorků a otevírá nové možnosti pro výzkum i průmyslové aplikace.

Reference

• D. Suckau, A. Resemann (2003) T³-Sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry, Anal Chem 75(21).
• Shevchenko A. et al. (2001) Charting the proteomes of organisms with unsequenced genomes by MALDI-quadrupole time-of-flight mass spectrometry and BLAST homology searching, Anal Chem 73(9).