Filling the gaps: multi-experiment de novo tag integration for confident top-down protein characterization in OmniScape

Multi-experimentální integrace de novo tagů pro top-down charakterizaci proteinů v OmniScape — shrnutí

Význam tématu:
Top-down hmotnostní spektrometrie (TD-MS) umožňuje přímou analýzu intaktních proteoform, což je klíčové pro detailní charakterizaci posttranslačních modifikací a izoform. Přesto de novo interpretace tandemových spekter zůstává problematická kvůli složitosti spekter, rozdílnému chování fragmentace, neúplnému pokrytí sekvence a závislosti výsledku na instrumentu. Metody, které dokáží spojit informace z více experimentů a fragmentačních režimů, zásadně zvyšují důvěru v lokální sekvenační značky (sequence tags) a následné vyhledávání homologických sekvencí.

Cíle a přehled studie / článku:
Autoři představují novou de novo sekvenační strategii implementovanou v softwaru OmniScape, která kombinuje spektra z různých MSn experimentů a multimodální fragmentace (různé režimy i různé nabité stavy) na platformě timsOmni. Cílem je vytvářet kvalitní kompozitní sequence tags, které zlepší lokální zarovnávací vyhledávání pomocí nástroje LYRA a tím zvýší přesnost a citlivost top-down identifikací a homology searchů.

Použitá metodika a instrumentace:

• Instrumentace: Bruker timsOmni hmotnostní spektrometr (timsOmni platforma) pro získání multimodálních MSn dat; software OmniScape s implementovaným de novo algoritmem a OmniWave dekonvolučním modulem; lokální zarovnávací nástroj LYRA pro homology search.
• Fragmentační režimy: ECD, CID, EID, ECciD, CCID/RCID a jejich kombinace; analýzy provedeny pro různé nabité stavy prekurzorů (příklady z dat: z = 31+, 34+, 37+).
• Algoritmus: C++ implementace, averagine model pro odhad izotopických distribucí, konstrukce spektrálního grafu z dekonvoluovaných špiček, generování kompozitních sequence tags z více experimentů a hodnocení tagů kombinovaným skórovacím metrikám zohledňujícím kvalitu a význam fragmentačních rysů.
• Vyhodnocení: testováno na anotovaných MS/MS datech bovinní karbonik anhydrázy II (CA II) a histonů (H3.1) získaných direct infusion multimodální fragmentací; výsledné tagy byly předloženy k lokálnímu vyhledávání pomocí LYRA.

Hlavní výsledky a diskuse:

• Integrace dat z různých nabitých stavů a fragmentačních režimů vedla ke vzniku delších a kvalitnějších sequence tags než při vyhodnocení jednotlivých spekter samostatně. U CA II kombinace tří nabitých stavů (z31, z34, z37) zvýšila celkové pokrytí sekvence (sequence coverage, SC) z jednotlivých hodnot přibližně 22–32 % na 44.6 % pro kombinovaný výsledek.
• U histonu H3.1 multimodální kombinace (ECD + EID + CID) vedla ke zvýšení SC až na ~66.2 %, oproti nižším hodnotám získaným z jednotlivých režimů (např. ECD ~19.9 %, CID ~14 %), což ukazuje na doplňkovost fragmentačních módů při vyplňování mezer v sekvenci.
• Kompozitní tagy zlepšily následné lokální zarovnávací výsledky: pro vybranou sekvenční oblast autoři hlásí zvýšení bit score zarovnání přibližně o 57 % (například z ~35 na 55) po integraci více experimentů.
• LYRA představuje vylepšení oproti standardnímu MS-BLAST přístupu tím, že explictě zohledňuje izobarické segmenty (isobaric segments) jako platné shody místo jejich považování za mezery či nesoulad. To zvyšuje citlivost a délku zarovnání, vede k vyšším bit skóre a lepšímu rozlišení homologických motifů.
• Technické poznámky: dekonvoluce založená na OmniWave a averagine modelu umožnila robustní identifikaci izotopických rozložení; spektrální grafická reprezentace umožnila spojování doplňkových fragmentů z více spekter do jedné kompozitní značky.

Přínosy a praktické využití metody:

• Zlepšená schopnost generovat dlouhé, spolehlivé de novo sequence tags z top-down dat zvyšuje pravděpodobnost správné identifikace proteoform a jejich variant bez závislosti na plné databázové shodě.
• Metoda efektivně vyplňuje mezery v lokálním pokrytí sekvence, což je kritické pro detekci PTM, proteolytických štěpení a dalších variací.
• Integrace s lokálním zarovnávacím nástrojem (LYRA) poskytuje citlivější homology search vhodný pro top-down aplikace, zejména tam, kde standardní MS-BLAST penalizuje izobarické segmenty.
• Workflow je implementován tak, aby byl kompatibilní s komplexními MSn sadami dat — vhodné pro výzkumné laboratoře i průmyslové aplikace vyžadující detailní proteoform charakterizaci.

Budoucí trendy a možnosti využití:

• Rozšíření integrace více dimenzí dat (např. mobilita iontů v tims, kvantitativní informace MS1/MSn) a real‑time řízení akvizice pro zacílení na chybějící sekvence během měření.
• Adaptace a škálování metody na komplexnější vzorky a větší proteomy, včetně automatizace slučování tagů z vysokého počtu experimentů.
• Využití strojového učení pro vylepšení skórovacích funkcí, filtrace artefaktů a predikci fragmentační chování pro neobvyklé PTM.
• Rozšíření přístupu pro robustnější identifikaci a lokalizaci modifikací a pro lepší integraci s databázovými i de novo přístupovými strategiemi v proteomice.

Závěr:
Autoři demonstrují, že multi-experimentální a multimodální přístup k de novo sekvenačnímu problému v top-down proteomice významně zvyšuje délku a kvalitu sequence tags, zlepšuje sekvenční pokrytí a zvyšuje úspěšnost lokálních homology searchů. Implementace v OmniScape doplněná LYRA poskytuje praktický workflow pro spolehlivější identifikaci proteoform, především tam, kde jednotlivé fragmentační režimy neposkytují dostatečné informace.

Reference:

• George Alevizos, Mariangela Kosmopoulou, Georgia Orfanoudaki, Detlev Suckau, Athanasios Smyrnakis, Liliane Soares, Dimitris Papanastasiou. ASMS 2026 (TH P649) — Filling the gaps: multi-experiment de novo tag integration for confident top-down protein characterization in OmniScape. Prezentace a data Bruker (2026).
• Upozornění na konflikt zájmů: autoři jsou zaměstnanci společností Fasmatech / Bruker a mohou mít finanční zájem na produktech prezentovaných v práci.