Targeted and untargeted metabolomics – a powerful hybrid workflow enabled by a biocrates kit on timsMetabo HRMS

Význam tématu

Metabolomika kombinuje kvantitativní cílené analýzy s nestrukturovaným objevováním metabolitů a poskytuje komplexní obraz biochemického stavu vzorku. Integrace standardizované, absolutně kvantitativní metody (biocrates kit) s vysokorozlišovacími, iontově-mobilitně rozlišenými daty (timsMetabo TIMS‑PASEF) umožňuje současně získat reprodukovatelná kvantitativní data i rozšířené strukturální informace. To je zásadní pro aplikace v klinickém výzkumu, QA/QC v průmyslu a studiích expozomu, kde je potřeba spojit přesné množství s hlubokou identifikací molekul.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo ukázat hybridní workflow, které v jedné datové akvizici kombinuje: (i) standardizovanou, validovanou kvantifikaci pomocí biocrates kitu a (ii) untargeted 4D metabolomiku založenou na TIMS‑PASEF produkující iontově‑mobilitně rozlišená MS/MS spektra pro hloubkové anotování funkcí a struktur. Studie porovnávala výkonnost timsMetabo HRMS s tradičním triple quad (EVOQ TQ+) a demonstrovala přínos rozšířené anotace ve skutečných lidských plasmatických vzorcích.

Použitá metodika a instrumentace

Popis postupu:

• Biologické vzorky: 21 individuálních lidských plazmat (11 mužů včetně jednoho lipemického, 10 žen) a referenční materiál NIST SRM 1950; vzorky zpracovány v 96‑destičkovém rozvržení a měřeny v triplicích.
• Příprava: použití biocrates kitu se dvěma 96‑well filtračními deskami; 30 µL vzorku rozděleno na dvě destičky (10 µL a 20 µL) s PITC (pro pozitivní mód) nebo 3‑NPH (pro negativní mód) derivatizací následovanou extrakcí.
• Akvizice: LC‑TIMS‑QTOF s PASEF (timsMetabo, Bruker) použitá v optimalizovaných MoRE PASEF metodách; současné měření umožnilo získat data pro cílenou i necílenou analýzu při jedné akvizici.
• Porovnání: referenční měření na EVOQ TQ+ (triple quadrupole) jako srovnávací standard pro kvantifikaci.
• Software a zpracování dat: TASQ 2026b a WebIDQ pro cílenou absolutní kvantifikaci; MetaboScape 2026b pro untargeted feature discovery a anotaci; export kvantifikovaných výsledků do MS Excelu pro vizualizaci a hodnocení výkonnosti.
• Spektra a knihovny: NIST 2023, Maurer et al. LC‑HR‑MS/MS Library of Drugs, Poisons, Bruker HMDB Metabolite Library 2.0. Cílové seznamy a in‑silico derivatizace vycházely ze zmíněných knihoven.

Instrumentace (shrnutí):

• timsMetabo (Bruker) – LC‑TIMS‑QTOF se PASEF akvizicí (MoRE PASEF metody)
• EVOQ TQ+ (Triple Quad) – referenční kvantitativní platforma
• Softwarové nástroje: TASQ 2026b, WebIDQ, MetaboScape 2026b
• Spektrální knihovny: NIST 2023, Maurer/Meyer/Helfer/Weber, Bruker HMDB Metabolite Library 2.0

Hlavní výsledky a diskuse

Výkonnost cílené kvantifikace:

• Počet detekovaných cílových analytů v plazmě: EVOQ TQ+ detegoval v průměru 259 ± 14, timsMetabo ~250 ± 11 (některé signály byly sumární pro koelutující izomery).
• Reprodukovatelnost: mediánový CV byl 6 % pro EVOQ a 8 % pro timsMetabo, tedy srovnatelná robustnost v rámci očekávaných rozdílů mezi platformami.
• Kvantitativní porovnání: naměřené koncentrace mezi přístroji byly porovnatelné; přesnosti certifikovaných analytů v NIST 1950 na timsMetabo se pohybovaly v rozmezí 80–120 %.

Výkonnost necílené (untargeted) 4D metabolomiky:

• Integrace TIMS zvýšila hloubku anotace přibližně trojnásobně v reálných lidských plazmatických vzorcích ve srovnání s pouhým cíleným seznamem.
• Ve spíkaném poolu QC3 bylo L1 (nejvyšší důvěra) anotováno 528 funkcí zahrnujících 291 analytů a 237 interních standardů (kombinace PITC a 3‑NPH workflowů).
• PITC (pozitivní mód) a 3‑NPH (negativní mód) poskytly komplementární mapy RT vs m/z; celkově byly získány stovky anotací s různými hladinami důvěry (L1, L2a, L2b, L3), přičemž L2 zahrnovaly MS/MS skóre a pokrytí fragmenty.
• Kombinace referenčních MS/MS, in‑silico derivatizace, predikce CCS a referenčních RT významně zlepšila schopnost anotovat molekuly mimo panel biocrates (např. expozomové molekuly, piperin, aspartam apod.).

Biologické postřehy a případové nálezy:

• Multivariátní analýza (PCA) ukázala jasné odlišení lipemického vzorku a částečné oddělení dle pohlaví, což potvrzuje biologický signál zachycený daty.
• Untargeted komponenty identifikovaly markery související s lipemií (např. lysophosphatidylcholiny) a expozomové látky (piperin, aspartam), které u jednoho jedince vykazovaly zvýšené hladiny.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní přínosy:

• Umožnění jediné akvizice pro cílenou kvantifikaci i necílené objevování šetří čas a materiál a zvyšuje konzistenci mezi kvantitativními a kvalitativními daty.
• TIMS přidává rozměr iontové mobility (CCS), který zlepšuje rozlišení izomerů a zvyšuje jistotu anotací ve spojení s MS/MS spektry a knihovnami.
• Standardizovaný biocrates kit zajišťuje reprodukovatelné retenční časy, kalibrační křivky a absolutní kvantifikaci vhodnou pro multi‑centrické studie a QA/QC aplikace.

Praktické aplikace:

• Klinický výzkum a biomarkerové studie, kde je potřeba robustní kvantifikace a doplňující strukturální informace.
• Studie expozomu, nutriční intervence a farmakometabolomika, kde necílená identifikace doplňuje panelové měření.
• Metodická validace a meziplatformní kontroly v laboratořích používajících kombinaci cílených kitů a HRMS technologií.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a implementace:

• Rozšiřování CCS knihoven a lepší kalibrace prediktivních modelů pro automatické zvýšení důvěry anotací.
• Propojení in‑silico nástrojů pro derivatizaci a fragmentaci s AI‑řízenými pipeline pro škálovatelné a rychlé anotování velkých datových souborů.
• Automatizace workflow a integrace do laboratorních LIMS pro rutinní nasazení v klinické a průmyslové praxi.
• Rozšíření metodiky na další biologické matrixy (moč, tkáně) a aplikace v populačních studiích a monitoringu expozomu.

Závěr

Prezentované hybridní workflow kombinuje silné stránky cílené, kit‑based kvantifikace s hloubkovou necílenou analýzou umožněnou TIMS‑PASEF. timsMetabo ukázal srovnatelnou kvantitativní výkonnost s triple quad platformou, přičemž TIMS‑rozlišení a bohaté MS/MS spektra umožnily výrazné rozšíření anotací — přibližně trojnásobně větší pokrytí metabolomu v reálných plazmatických vzorcích. Tento přístup je vhodný pro studie požadující jak přesnou množstevní informaci, tak širší kontext molekulárních změn.

Reference

Hai Pham‑Tuan, Aiko Barsch, Cristian De Gobba, Nikolas Kessler, Ilmari Krebs, Martin Buratti, Agnes Scharrer, Doreen Kirchberg, Ulf Sommer, Guido Dallmann, Matthew R. Lewis. Targeted and untargeted metabolomics – a powerful hybrid workflow enabled by a biocrates kit on timsMetabo HRMS. Poster SMS 2026, WP 519. Bruker Corporation, 2026. Upozornění: Autoři jsou zaměstnanci Bruker Corporation nebo jejích dceřiných společností. Pro výzkumné účely, nikoli diagnostické použití.