Decoding Dietary Signatures in Human Fecal Metabolomes Using a Novel timsTOF Platform

Význam tématu

Analýza lidského fecálního metabolomu poskytuje klíčové informace o interakcích mezi dietou, mikrobiomem a hostitelským metabolizmem. Vývoj robustních, reprodukovatelných workflow a využití referenčních materiálů (NIST RM 8048) je zásadní pro standardizaci metod, mezi-laboratorní srovnatelnost a vytváření digitálních archivů metabolomů, které podporují biomarker discovery, nutriční výzkum a metody QA/QC v protokolech metabolomiky.

Cíle a přehled studie / článku

Studie měla za cíl provést hluboké profilování NIST RM 8048 (pool stolice od vegetariánů a všežravců) pomocí komplementárních chromatografických metod (HILIC a RP) v kombinaci s vysokorozlišovacím TIMS-QTOF (timsMetabo) za účelem maximalizace pokrytí polaritních tříd sloučenin. Cílem bylo vytvořit počáteční "digitální metabolomickou krajinu" pro toto referenční materiál, identifikovat tisíce analytických signálů, a ukázat použití multidimenzionálních kritérií (m/z, RT, MS/MS, CCS) pro zlepšení jistoty anotací.

Použitá metodika a instrumentace

Metodikou bylo kombinování více extrakcí a chromatografických režimů, aby se pokryla široká polarity sloučenin:

• Extrahování: 20% ACN/80% H2O pro HILIC; 25% MeOH/25% iPrOH/50% H2O pro RP (metabolomika); 50% MeOH/50% MTBE pro lipidomiku.
• Chromatografie HILIC: Waters BEH Z-HILIC (100×2.1 mm, 1.7 µm). Mobilní fáze s amonnými pufry/formiátovou kyselinou pro pozitivní i negativní režim.
• Chromatografie RP (metabolomika): Phenomenex Kinetex C18 (100×2.1 mm, 1.7 µm) a Cortecs UPLC C18 (150×2.1 mm, 1.6 µm) pro lipidomiku; modifikované organické fáze včetně iPrOH pro lipidy.
• Detekce: timsMetabo TIMS-QTOF s PASEF a MoRE režimy (m/z rozmezí 20–1500), měření CCS (TIMS CCS N2), MS/MS acquisice.
• Software a postprocessing: MetaboScape 2026b (peak detection, recalibration, počáteční anotace), R ekosystém (RforMassSpectrometry), Sirius s CSI:FingerID a predikce CCS (LipidCCS).

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky ukázaly rozsáhlé pokrytí signálů napříč metodami:

• Byly detekovány tisíce feature pro každou kombinaci LC/ionizačního módu (řádově 3–8 tisíc, v lipidomice až ~8 400 feature v pozitivním módu před filtrováním MS/MS).
• Po kontrole vůči blankům a replikovatelnosti (~detekce v 2/3 replikátů) se 70–80 % feature překrývalo mezi vzorky od všežravců a vegetariánů, přičemž část signálů vykazovala dietě specifické trendy.
• Použití multidimenzionálních kritérií (m/z, RT, MS/MS, měřené CCS) zvýšilo jistotu anotací a umožnilo putativní přiřazení řady dosud ne zcela popsáných molekul, včetně mastných esterů hydroxy žlučových kyselin (např. estery FA 16:1 s cholovou kyselinou).
• Příkladné validace CCS ukázaly dobré souladnosti mezi měřenými a predikovanými/ referenčními hodnotami (odchylky v jednotkách procent), což posiluje důvěryhodnost identifikací lipidů a polarních metabolitů.
• Některé nepotvrzené lipidní feature byly vyšší ve vzorcích vegetariánů a představují zajímavé cíle pro další strukturální charakterizaci.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní přínosy a využití zahrnují:

• Komplexní digitální metabolomické archivy umožňují dlouhodobé porovnávání studií a standardizované benchmarky pro mezi-laboratorní porovnání.
• Integrace TIMS-CCS s MS/MS a RT poskytuje vyšší jistotu anotací než izolované m/z-based přístupy, což urychluje objev nových kandidátních markerů.
• Metodika je vhodná pro průmyslové i akademické aplikace: vývoj biomarkerů, nutriční studie, studie mikrobiomu a validace metod pro QA/QC biologických matic.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikací:

• Rozšiřování a standardizace CCS databází a jejich integrace do anotovacích pipeline pro vyšší automatizaci a přesnost.
• Hlubší strukturální charakterizace dosud neanotovaných signálů (cílené MSn, chemická derivatizace, syntéza standardů) zaměřená na dietě specifické molekuly.
• Propojení digitálních metabolomických archivů s klinickými a mikrobiomickými daty pro víceúrovňové biomarkerové studie.
• Využití strojového učení pro predikci původu signálů (host vs. mikrobiom vs. dieta) a pro prioritizaci kandidátů k validaci.

Závěr

Tato studie představuje první podrobný profil NIST RM 8048 za použití komplementárních LC režimů a TIMS-QTOF platformy. Výsledkem jsou tisíce reprodukovatelných feature a početné putativní anotace, včetně zajímavých nových lipidů (např. estery hydroxy žlučových kyselin). Kombinace MS, MS/MS, RT a CCS ukázala vysokou hodnotu pro budování kvalitních digitálních metabolomických archivů a pro směřování dalších strukturálních studií a standardizačních iniciativ.

Použitá instrumentace

• timsMetabo TIMS-QTOF (Bruker) s PASEF a MoRE režimy pro akvizici MS a MS/MS a pro měření TIMS-CCS.
• Chromatografické kolony: Waters BEH Z-HILIC (100×2.1 mm, 1.7 µm), Phenomenex Kinetex C18 (100×2.1 mm, 1.7 µm), Waters Cortecs UPLC C18 (150×2.1 mm, 1.6 µm).
• Rozličné extrakční protokoly (ACN/H2O, MeOH/iPrOH/H2O, MeOH/MTBE) přizpůsobené typu analyzovaných tříd sloučenin.
• Softwarové nástroje: MetaboScape 2026b, R balíčky z RforMassSpectrometry ekosystému, Sirius + CSI:FingerID, predikční nástroje pro CCS (LipidCCS).

Reference

1. Witting M., Rellin K.F., Rizou T., Virgiliou C., Theodoridis G., Barsch A., Lewis M.R. Decoding Dietary Signatures in Human Fecal Metabolomes Using a Novel timsTOF Platform. A SMS 2026, TP524. Metabolomics and Proteomics Core, Helmholtz Zentrum München; TUM; Aristotle University of Thessaloniki; Bruker Daltonics. 2026.
2. NIST Reference Material 8048: Human Fecal Material (populated pooled material) — použit jako referenční matrix pro tento výzkum.
3. Cruz et al. (uvedeno v textu jako předchozí práce) — zmínka o dříve detekovaných metabolitech v kontextu NIST 8048 (detailní citace v originálním materiálu).