Confident 4D Annotation of Polar Metabolites Using Standardized Retention Times Combined with TIMS-HRMS Acquisition

Význam tématu

Metabolomika malých polárních metabolitů čelí obtížím způsobeným izomerismem, omezenými knihovnami standardů a variabilitou chromatografických retenčních časů. Kombinace standardizovaných retenčních časů s měřenými kolizními průřezy (CCS) na LC-TIMS-MS platformách přináší víceřádkové (4D) kritérium pro zvyšování jistoty anotace sloučenin. To má význam pro kvalitativní i polo-kvantitativní studie v biomedicínském a experimentálním výzkumu, kde je potřeba spolehlivě sledovat změny v primárním metabolismu a lipolýze.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce je demonstrovat proof-of-concept workflow, který využívá: standardizované retenční časy z biocrates MxQuant 3-NPH derivatizační sady, experimentálně získané CCS hodnoty na timsTOF Pro2 a více kritérií (m/z, izotopické rozložení, RT, CCS, MS/MS) pro vysokou jistotu anotace 3-NPH derivatizovaných polárních metabolitů. Dále autoři ukazují rozšíření anotací pomocí in-silico derivatizace a aplikují postup na časovou analýzu murinních hnědých adipocytů stimulovaných noradrenalinem.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Derivatizace metabolitů 3-hydroxymethylfenylhydrazinem (3-NPH) za standardních podmínek (směs vzorku s NPH a EDC, 1 h při pokojové teplotě, quenched BHT).
• Analýza pomocí UHPLC s chromatografií dle biocrates MxQuant sbalené metody pro derivatizované analyty.
• Akvizice na LC-TIMS-PASEF platformě (negativní ionizace, VIP HESI) a získání experimentálních CCS hodnot na timsTOF Pro2.
• Automatizovaná datová analýza v MetaboScape 2026b: kalibrace hmotnosti a mobility, 4D extrakce signálů, deadducting, de-isotopizace, skupinování, AQScore vyhodnocení.
• In-silico derivatizace: rozšíření strukturální knihovny (InChI/SMILES) o teoretické 3-NPH produkty, predikce CCS a in-silico MS/MS pro vícekriteriální skórování.

Instrumentace (shrnutí):

• timsTOF Pro2 — měření experimentálních CCS hodnot.
• timsMetabo (Bruker) s VIP HESI zdrojem, LC-TIMS-PASEF akvizice.
• UHPLC systém kompatibilní s biocrates MxQuant Mx kit chromatografií.
• MetaboScape 2026b software pro 4D zpracování, AQScore a in-silico derivatizaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Vybrané výsledky:

• Vytvoření 4D Target Listu obsahujícího 100 3-NPH derivatizovaných metabolitů, kde každá položka obsahuje přesnou m/z, standardizovaný RT (dle MxQuant metody), experimentální CCS (měřeno na timsTOF Pro2) a SMILES/InChI strukturu.
• AQScore založený na pěti ortogonálních kritériích (m/z, RT, izotopický vzorec – mSigma, MS/MS porovnání, CCS) umožňuje vizuálně i kvantitativně hodnotit jistotu anotací.
• In-silico derivatizace a predikce CCS/MS/MS doplňuje target-based přístup a umožňuje anotovat sloučeniny bez referenčních standardů.
• Aplikace workflow na 3-NPH derivatizované extrakty murinných hnědých adipocytů po stimulaci noradrenalinem (0, 4, 24 h) ukázala: transientní nárůst středně a dlouhořetězcových mastných kyselin (např. stearová, myristová, olejová) v čase 4 h, následovaný návratem k bazálním úrovním po 24 h; metabolické posuny v primárním metabolismu — zvýšení laktátu, propionátu, pyruvátu a β-alaninu v čase; pokles malátu, aspartátu a glycinu v 4 h s normalizací po 24 h.

Diskuse:

• Kombinace RT kotviček z derivatizační sady a experimentálních CCS zvyšuje přenositelnost anotací mezi laboratořemi a různými TIMS platformami.
• Vícekriteriální přístup redukuje falešné pozitivy způsobené izomery a artefakty derivatizace.
• In-silico rozšíření knihovny zvyšuje pokrytí neznámých nebo nekomerčně dostupných derivátů, ale spolehlivost predikcí závisí na kvalitě modelů pro CCS a fragmentaci.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda umožňuje vysokou důvěru v anotaci polárních metabolitů v komplexních biologických maticích, důležitou pro studium centralního metabolismu, lipolýzy a metabolických změn při stimulaci buněk.
• Target List s RT a CCS lze přenášet mezi laboratořemi používající obdobné chromatografické metody a TIMS přístroje, což zlepšuje reprodukovatelnost výsledků.
• Workflow podporuje jak cílené sledování klíčových metabolitů, tak objevování nových derivátů pomocí in-silico nástrojů, čímž slouží laboratorím v préklinickém výzkumu i v QA/QC prostředí, kde je důležitá jednoznačná identifikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vylepšení prediktivních modelů CCS a in-silico fragmentace povede k přesnějším anotacím bez nutnosti standardů pro každou sloučeninu.
• Rozšiřování standardizovaných RT kotviček pro jiné derivatizace a platformy zvýší interoperabilitu mezi laboratořemi a databázemi.
• Integrace 4D výsledků do větších multi-omických studií (proteomika, lipidomika, transkriptomika) umožní komplexnější pohled na biologické reakce, např. termogenezi a metabolické adaptace.
• Standardizované sdílení 4D Target Listů a CCS databází by mohlo urychlit konsolidaci metabolomických knihoven a snížit závislost na komerčních standardech.

Závěr

Studie předvádí funkční 4D workflow pro zvýšení jistoty anotace 3-NPH derivatizovaných polárních metabolitů kombinací přenosných retenčních časů a experimentálních CCS hodnot. Doplnění o in-silico derivatizaci zvyšuje pokrytí analyzovaných sloučenin. Aplikace na časový průběh aktivace hnědých adipocytů potvrzuje schopnost metody sledovat biologicky relevantní metabolické změny spojené s lipolýzou a primárním metabolismem.

Reference

1. Anagho-Mattanovich M. et al. Multi-omics analysis of thermogenic lipolysis in brown adipocytes, 2025.
2. Bruker. TIMS-enabled 4D-Metabolomics workflow for the automated analysis of derivatized analytes; Bruker SN-05.
3. Zeck, S. et al. Lipolysis – A highly regulated multi-enzyme complex mediates the catabolism of cellular fat stores; review article, 2010.