prio-PASEF: Precision and Discovery in MetID Workflows

Význam tématu

Metabolická identifikace (MetID) je klíčová pro hodnocení bezpečnosti a účinnosti léčiv. Moderní LC-TIMS-MS přístroje umožňují čtyřrozměrné (4D) rozlišení látek podle hmotnosti, retenčního času, iontové mobility a kolizní cross-section (CCS). Přesné zachycení jak očekávaných, tak neočekávaných biotransformačních produktů je podmínkou pro komplexní farmakologické a toxikologické studie.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři představují novou datově řízenou akviziční strategii nazvanou prio-PASEF (Parallel Accumulation Serial Fragmentation), která umožňuje:

• prioritizovat selekci předvídaných metabolitů (targeted MetID),
• využít zbývající akviziční čas pro netargetované DDA (data dependent acquisition),
• využít iontovou mobilitu pro čistší MS2 spektra a měření CCS.

Studie využívá oxidaci a konjugaci testosteronu v lidských hepatocytech pro demonstraci výkonu prio-PASEF oproti standardnímu dda-PASEF.

Použitá metodika a instrumentace

Experimenti probíhaly na systému timsTOF pro LC-TIMS-MS s následující konfigurací:

• Chromatografie: LC s běžnými metodami pro nepolární steroidy.
• Iontová mobilita: TIMS modul pro 4D měření (m/z, čas, mobilita, CCS).
• Akviziční režimy: prio-PASEF skrze APIo skript v timsControlu a standardní dda-PASEF.
• Software pro analýzu: MetaboScape 2025 pro 4D feature finding, spektrální knihovny a kvantifikaci.
• Vzorky: Kryokonzervované lidské hepatocyty s osmi časovými body inkubace a třemi biologickými replikáty.

Hlavní výsledky a diskuse

1. Selektivita a citlivost

• prio-PASEF upřednostnilo nízkokoncentrované produkty (testosteron-glukuronid) a získalo kvalitní MS2 spektrum i při minimálních intenzitách.
• Standardní dda-PASEF chyběl apex fragmentace u cílových látek s nízkou hořlavostí.

2. Pokrytí netargetovaných látek

• V netargetovaném režimu bylo identifikováno přes 480 4D feature, z nichž 310 unikátních doprovázelo kvalitní MS2 spektrum.
• Iontová mobilita podpořila separaci souběžně elujících izomerů.

3. Kvalita dat

• Čistota spekter a měření CCS umožnilo zvýšení důvěryhodnosti přiřazení a snížení nesprávných anotací.

Přínosy a praktické využití metody

prio-PASEF spojuje cílenou a netargetovanou analýzu v jednom běhu, což vede k:

• Zvýšené efektivitě laboratoře – méně nahrávání metody a delší využití dat.
• Lepší detekci nízkoabundantních metabolitů bez ztráty netargetovaných komponent.
• Vyšší důvěryhodnosti díky 4D analýze (m/z, čas, mobilita, CCS).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávaný rozvoj zahrnuje:

• Automatizované vytváření prioritních seznamů pomocí strojového učení.
• Integrované spektrální a CCS databáze pro okamžitou identifikaci.
• Rozšíření na další matrice (plazma, močí, rostlinné extrakty).
• Kompatibilitu s vysoce propustnými (high-throughput) platformami a online bioreaktory.

Závěr

prio-PASEF představuje inovativní metID workflow, které zvyšuje citlivost na nízké koncentrace cílových metabolitů a zároveň udržuje široké pokrytí netargetovaných látek. Využitím iontové mobility a měření CCS se zlepšuje kvalita MS2 dat a spolehlivost identifikace, což výrazně přispívá ke komplexnímu zhodnocení biotransformačních procesů.

Reference