Location, Location, Location… Native Top-Down Mass Spectrometry Provides Binding Site Information for Protein-Ligand and Protein- Protein Interactions

Význam tématu

Native top-down mass spectrometry (nTDMS) představuje přímý přístup k analýze intaktních proteinových komplexů v plynné fázi, umožňující současné získání informací o hmotnosti komplexu, stechiometrii, aminokyselinovém pořadí a post‑translačních modifikacích. Schopnost zachovat nekovalentní vazby během fragmentace a lokalizovat místa vazby ligandů či protein–protein interakcí je kritická pro porozumění funkci biologických komplexů, vývoji léčiv a kvalitativní i kvantitativní kontrole v biotechnologii.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované práce bylo demonstrovat schopnost platformy timsOmni využívající zachycené EXD procesy (tEXD) v kombinaci s MSn workflow přesně mapovat místa vazby ligandů a kontaktní rozhraní mezi podjednotkami proteinových komplexů. Studie ukazuje aplikace na dvou modelech: holo‑myoglobin (heme‑protein) a L‑malát dehydrogenázu (L‑MDH) homodimeru, s důrazem na kombinaci RCID, ECD, EID a vícestupňového MSn pro maximalizaci sekvenčního pokrytí a lokalizaci chráněných oblastí interakce.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: komerčně dostupný holo‑myoglobin (koňský) a L‑malát dehydrogenáza (prasátko); buffer exchange do 150 mM ammonium acetátu; koncentrace 5 µM; nano‑ESI pomocí Humanix Cellomics emitters a zdroje NEOS.
• Ionizace a příprava: in‑source CID v argonu pro lepší desolvaci a uvolnění podjednotek z komplexů.
• Separace/isolation: m/z výběr a hromadění v Bruker Omnitrap/timsOmni, RF generátor umožňující izolaci až do 4500 Th; iontové akumulace >100 ms a akumulace spekter ~3 min pro zvýšení S/N.
• Metody aktivace: rezonanční CID (RCID), electron capture dissociation (ECD), electron ionization dissociation (EID), kombinované režimy včetně ECciD a vícestupňových MSn (MS2, MS3) pro cílené hluboké sekvenování.
• Detaily platformy: externí elektronový zdroj napojený na kvadrupól Q5 s přesnou kontrolou energie elektronů a doby ozáření (tEXD), iontová konfinační oblast optimalizovaná pro maximalizaci výtěžku fragmentů.
• Software: OmniScape pro zpracování a interpretaci top‑down dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• L‑MDH homodimer (66 kDa): MS2 RCID dimeru (z=17+) poskytlo ~44 % sekvenčního pokrytí (SC), především z C‑terminální části, která je solventně exponovaná. MS2 ECD a MS2 EID dimeru poskytly každé ~49 % SC zaměřené rovněž na C‑konec. Další MS3 analýzy uvolněného monomeru (z=10+) pomocí EID dosáhly až 63 % SC a umožnily sejít hlouběji do jádra monomeru. Kombinací experimentů na dimeru a monomeru bylo dosaženo celkového SC ~92 %. Oblast M227–R233 nebyla detekována ve fragmentech MS2, což svědčí o její ochraně a zapojení do těsného protein–protein kontaktu.
• Holo‑myoglobin: MS2 ECD (z=8+) generovalo c‑/z fragmenty v oblasti H64–H93 s fragmenty obsahujícími i vázané heme, což dokládá, že tEXD procesy mohou zachovat nekovalentní ligand při fragmentaci. RCID dával ~68 % SC, ale často vedl k odtržení heme. Kombinovaný set MS2 RCID, MS2 ECD a MS3 RCID poskytl celkové SC ~99 %. Pozorované těžší c‑fragmenty vykazovaly rozšířené izotopické rozložení posunuté o ~2H, pravděpodobně v důsledku změn oxidačního stavu Fe‑heme při kolizní aktivaci. He‑me může zůstat přidružený k fragmentům na obou histidinových pozicích, což svědčí o variantní lokalizaci vazby v plynné fázi.
• Obecné poznatky: kombinace tEXD (ECD/EID) s konvenční CID v rámci MSn workflow zásadně zvyšuje hloubku sekvenční informace a umožňuje geografické lokalizace chráněných oblastí vazeb a rozhraní, které jsou netransparentní při jediném režimu fragmentace.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost lokalizovat místa vazby ligandů a interfacialní segmenty podjednotek bez nutnosti kovalentního značení nebo krystalografických postupů.
• Užitečné pro vývoj léčiv (mapping vazebných míst), studium stabilních i přechodných komplexů, charakterizaci PTM v kontextu celého proteinu a QA/QC v biotechnologickém průmyslu.
• Vysoká flexibilita platformy timsOmni umožňuje optimalizovat workflow podle velikosti komplexu a charakteru interakcí (nekovalentní vs. kovalentní), čímž se zvyšuje informační výtěžnost z jednoho experimentu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s ion mobility pro rozlišení konformačních izomerů komplexů a lepší spojení strukturálních a sekvenčních informací.
• Automatizace MSn metodik a rozšíření softwarových nástrojů pro rychlé přiřazení fragmentů a lokalizaci vazeb v rozsáhlých datech.
• Kombinace nTDMS s komplementárními technikami (crosslinking‑MS, cryo‑EM, HDX‑MS) pro robustní mapování interakcí v rámci integrativní strukturní biologie.
• Vylepšení elektronových zdrojů a přesnosti řízení energie pro jemnější kontrolu tEXD procesů a minimalizaci nežádoucí ztráty ligandů.

Závěr

Prezentovaná data demonstrují, že timsOmni vybavený zachycenými EXD procesy a schopností provádět cílené MSn experimenty nabízí výkonný toolbox pro lokalizaci vazebných míst ligandů a identifikaci protein–protein rozhraní u intaktních komplexů. Na modelech L‑MDH a holo‑myoglobinu bylo prokázáno vysoké sekvenční pokrytí kombinovanými režimy fragmentace, identifikace chráněné oblasti rozhraní a zachování vazby heme v řadě fragmentů. Metoda je vhodná pro aplikace v základním výzkumu i průmyslové analýze a má perspektivu dalšího rozvoje ve spojení se strukturálními a softwarovými nástroji.

Reference

• A. Smyrnakis, M.‑A. Kosmopoulou, D. Papanastasiou, I. Sakallioglu, M. Greig, M. Kensil, J. A. Loo: Native top‑down mass spectrometry on timsOmni for mapping ligand and protein–protein binding sites. ASMS 2026; prezentace/konferenční příspěvek. Data a výsledky jsou spojeny s produktem Bruker timsOmni.