Scaling-up low input spatial proteomics using Evosep Eno on the timsUltraAIP

Význam tématu

Analýza proteomu s vysokou citlivostí a současně vysokým průtokem vzorků je klíčová pro charakterizaci fenotypické diverzity buněk ve složitých tkáních a pro studií velkých klinických kohort. Kombinace miniaturizované přípravy vzorků, ultracitlivé hmotnostní spektrometrie a rychlých, standardizovaných chromatografických metod umožňuje dosahovat hlubokého proteomického pokrytí i při velmi nízkých vstupech (jednotlivé buňky, malé laserově vyřezané oblasti FFPE). To otevírá cestu k robustnímu prostorovému proteomickému mapování a škálovatelnému workflow vhodnému pro výzkum i aplikace v oblasti translace a diagnostiky.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit výkonnost, reprodukovatelnost a škálovatelnost workflow kombinující cellenONE pro miniaturizovanou přípravu, Evosep Eno pro rychlou a standardizovanou separaci peptidů a ultrasenzitivní hmotnostní spektrometr timsUltra AIP s dia-PASEF akvizicí. Studie benchmarkovala metodu na sadě vzorků zahrnujících K562 digest (diluční řada 100 ng až 0,25 ng), jednotlivé FaDu a HeLa buňky (single a 10-cell mini-bulks) a laserově mikrodisekované oblasti lidské FFPE tonsilní tkáně (30 000 µm²) reprezentující epitel, B- a T-buňky.

Použitá metodika

• Izolace vzorků: single-cell náběr do proteoCHIP EVO96 a laserová mikrodisekce (LMD) s gravitačním sběrem do proteoCHIP EVO96 pro FFPE oblasti.
• Příprava vzorků: lýza, denaturace (včetně kroku při 65 °C), redukce, alkylace a tryptická digesce provedená v cellenONE X1 Neo; doba přípravy ~2–2,5 h v závislosti na protokolu.
• Čištění: přenos digestů na Evotips Pure pro naložení na chromatografii.
• Chromatografie: Evosep Eno se standardními Evosep gradienty (500, 300, 200, 100, 60, 30 SPD = samples per day) a speciálními Whisper Zoom gradienty (120, 80, 40 SPD) optimalizovanými pro single-cell analýzy.
• MS akvizice: dia-PASEF režim na timsUltra AIP.
• Datová analýza: Spectronaut 21 v režimu directDIA (bez využití match-from-higher-loads pro část analýz); u některých analýz použita imputace chybějících hodnot pomocí downshifted normal distribution.

Použitá instrumentace

• Evosep Eno (Evosep) pro rychlou a reprodukovatelnou LC separaci; použity standardní a Whisper Zoom gradienty.
• timsUltra AIP (Bruker) pro ultrasenzitivní dia-PASEF akvizici.
• cellenONE X1 Neo (Cellenion) pro přesné nanodispenzování, lysis a digest v proteoCHIP EVO96.
• proteoCHIP EVO96 pro sběr a zpracování velmi malých objemů / jednotlivých buněk.
• Evotips Pure pro naložení peptidových digestů do LC systému.
• Analytické kolony a cartridgy z řad PepSep/Evosep (různé délky a partikule uváděné v textu: např. 4 cm, 8 cm, 15 cm, průměr 150 µm, 1.5–1.9 µm), které ovlivňují separační výkon v závislosti na rychlosti gradientu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Senzitivita a rozsah identifikací: Pro K562 digest byl zaznamenán vynikající výkon napříč gradienty a naloženími. Při velmi nízkém naložení 250 pg na Evotip bylo dosaženo přibližně 1 600 proteinových skupin a ~8 700 prekurzorů při 500 SPD; při delších (pomalejších) 60 SPD gradientech se to zlepšilo až na ~3 900 proteinových skupin a ~34 000 prekurzorů. Při nejvyšším naložení 100 ng bylo identifikováno ~5 800 proteinových skupin (~53 000 prekurzorů) při 500 SPD a ~8 400 proteinových skupin (~138 000 prekurzorů) při 60 SPD.
• Single-cell výkon: Jednotlivé FaDu a HeLa buňky vykázaly „excelentní“ pokrytí proteomu jak na standardních gradientech (500–60 SPD), tak na Whisper Zoom 120–40 SPD optimalizovaných pro single-cell. To potvrzuje vhodnost kombinace Evosep Eno a timsUltra AIP pro vysoce citlivé single-cell proteomiky.
• Prostorová rozlišitelnost v FFPE tkáni: Laserově mikrodisekované oblasti (30 000 µm²) z lidské tonsily reprezentující epitel, B- a T-buňky vykazovaly konzistentní identifikace buněčných markerů (např. CD3 prostředí pro T-buňky, CD19 pro B-buňky, CDH1 a keratiny pro epitel) napříč všemi standardními gradienty (500–30 SPD). To ukazuje, že i velmi krátké běhy zachovávají biologicky relevantnou informaci o buněčných populacích v FFPE vzorcích.
• Reprodukovatelnost a multigradientová konzistence: Pearsonovy korelační matice a PCA analýzy prokázaly vysokou shodu mezi stejnými typy náchysek napříč různými rychlostmi gradientů. Po aplikaci imputace (downshifted normal distribution) byly diferenciace mezi nápadnými buněčnými nápníky ještě zřetelnější; volcano analýzy potvrdily statistické zvýraznění známých markerů mezi nikami.
• Škálovatelnost: Použití standardizovaných Evosep Eno metod (různé SPD) umožňuje flexibilní volbu mezi maximálním průtokem (vyšší SPD, kratší běhy) a hloubkou proteomu (nižší SPD, delší běhy), aniž by se zásadně ohrozila schopnost rozlišit buněčné populace ve tkáni.

Přínosy a praktické využití metody

• Workflow umožňuje škálovat od single-cell po hluboké proteomické mapování malých laserových výřezů FFPE, což jej činí vhodným pro projekty prostorové proteomiky, biomarker discovery a translaci do klinických studií.
• Standardizované Evosep Eno metody zaručují reprodukovatelnost a rychlou adaptaci mezi laboratořemi; kombinace s timsUltra AIP poskytuje vysokou citlivost i při velmi nízkých vstupech.
• Možnost volby mezi vysokým průtokem a maximální hloubkou identifikací dává flexibilitu plánování velkých kohortních studií bez nutnosti zásadních kompromisů v kvalitě dat.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dálší miniaturizace a automatizace přípravy vzorků (vyšší paralelizace v proteoCHIP konstrukcích) pro zrychlení throughputu a snížení variability.
• Integrace spatial proteomics s dalšími omickými vrstvami (transkriptomika, metabolomika, prostorová imunosondáž) pro komplexní 4D-multiomics profily tkání.
• Optimalizace chromatografických gradientů a dalších hardware parametrů (nové kolony, optimalizované Whisper Zoom módy) k dosažení lepší citlivosti pro jednotlivé buňky bez ztráty průtoku.
• Vývoj pokročilých algoritmů pro directDIA a imputaci (včetně AI-přístupů) pro spolehlivější kvantifikaci nízkoobsažných proteinů a robustnější integraci dat z různých běhů.
• Přechod k validovaným pracovním postupům vhodným pro regulované prostředí (klinické laboratoře) s důrazem na standardizaci, kvalitu a sledovatelnost výsledků.

Závěr

Kombinace cellenONE-based miniaturizované přípravy vzorků, Evosep Eno pro rychlou standardizovanou LC separaci a timsUltra AIP v dia-PASEF režimu poskytuje citlivé, reprodukovatelné a škálovatelné řešení pro spatial proteomics od single-cell až po malé laserově vyřezané oblasti FFPE. Metoda dosahuje solidního proteomického pokrytí i při sub-ng vstupech a zachovává schopnost rozlišit buněčné populace napříč širokým rozsahem rychlostí běhu, což ji činí slibnou pro rozsáhlé biologické a klinické aplikace.

Reference

1. P. Skowronek, M. Mann et al., Molecular & Cellular Proteomics, 2022, 21(9), 100279.
2. Application Note, Bruker Daltonics, LCMS-206, 1815135, 2023.
3. Application Note, Bruker Daltonics, LCMS-213, 1901456, 2023.
4. Application Note, Bruker Daltonics, LCMS-222, 1911577, 2024.
5. Application Note, Bruker Daltonics, LCMS-228, 1914261, 2024.
6. Application Note, Bruker Daltonics, LCMS-233, 1915345, 2025.
7. Application Note, Bruker Daltonics, LCMS-238, 1918674, 2025.
8. Application Note, Bruker Daltonics, LCMS-261, 1929343, 2026.
9. Application Note, Bruker Daltonics, LCMS-262, 1929349, 2026.

Poznámka: Autoři uvedli konflikt zájmů — někteří jsou zaměstnanci Bruker, Evosep nebo Cellenion.