Targeted Lipidomic Analysis in Human Milk Using LC-MS/MSTriple Quadrupole

Cílená lipidomika lidského mateřského mléka pomocí LC-MS/MS na triplekvadruplu — Shrnutí posteru ASMS 2026 (WP 327)

Význam tématu

Lidské mateřské mléko obsahuje komplexní a funkčně důležitý lipidom, který zásobuje novorozence energií, stavebními bloky membrán a signálními molekulami ovlivňujícími imunitní vývoj a trávení. Analytická charakterizace tohoto lipidomu je náročná kvůli širokému dynamickému rozsahu koncentrací, přítomnosti izomerů a silným matrice efektům. Robustní, citlivé a kvantitativní metody jsou klíčové pro populační studie, sledování výživy a identifikaci potenciálních biomarkerů zdraví kojenců.

Cíle a přehled studie

- Vyvinout vysokoprůtokový, cílený LC–MS/MS pracovní postup využívající triple kvadrupól pro kvantitativní analýzu lipidů v lidském mléce.
- Zajistit širé pokrytí lipidových tříd (>50 podtříd) pomocí rozšířeného dynamického MRM panelu (>1 200 cílených analyzátů).
- Optimalizovat extrakci, chromatografii a kvantifikaci tak, aby byla dosažena vysoká citlivost (LOQ do ~0,002 µg/mL), reprodukovatelnost a korekce matrice efektů.

Použitá metodika

- Vzorek: 100 µL lidského mléka.
- Příprava: přidání směsi izotopově značených interních standardů; extrakce přidáním methanol:butanol 1:1 do celkového objemu 1 mL; vortex, sonikace, odstředění a sběr supernatantu pro přímé injekční analýzy.
- Kalibrace a validace: použití tří sad standardů — nejdříve před extrakcí (pre-spike), po extrakci (post-spike) a standardy v rozpouštědle — pro hodnocení linearity, LOQ, účinnosti extrakce, přesnosti a matrice efektu. Koncentrace kalibračních bodů: 0,01–1 µg/mL (u některých IS i 0,002–0,2 µg/mL).

Použitá instrumentace

• UHPLC: Agilent 1290 Infinity III.
• Kolona: Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, 1.8 µm, 2.1 x 100 mm.
• Chromatografie: teplota kolony 45 ± 2 °C, objem injekce 3 µL, průtok 0,40 mL/min; autosampler 20 ± 2 °C.
• Mobilní fáze A: 10 mM amonný formiát, 5 µM deactivator additive v poměru 5:3:2 voda:acetonitril:isopropanol.
• Mobilní fáze B: 10 mM amonný formiát v 1:9:90 voda:acetonitril:isopropanol.
• MS: Agilent 6495D triple-quadrupole s Agilent Jet Stream ESI (pozitivní/negativní režim), akvizice v dynamickém MRM režimu.
• Vybrané MS parametry: drying gas 150 °C, průtok 17 L/min, nebulizér 20 psi, sheath gas 200 °C/10 L/min, kapilára 3500 V (ESI+) / 3000 V (ESI-), nozzle 1000 V (ESI+) / 1500 V (ESI-).

Hlavní výsledky a diskuse

- Pokrytí: v 16minutovém LC běhu bylo detekováno a potvrzeno přes 800 lipidních druhů napříč klíčovými rodinami (ceramidy, cholesteryl estery, diacylglyceroly, volné mastné kyseliny, glycerofosfolipidy, triacylglyceroly apod.).
- Citlivost: dosaženy LOQ až ~0,002 µg/mL pro vybrané interní standardy a analyty, umožňující kvantifikaci nízkoabundančních signálních lipidů.
- Validace: extrakční korektované recovery (CR) v rozmezí přibližně 72–129 % u různých IS; přesnost (CV) ≤20 %; r2 hodnoty kalibračních křivek >0,99 pro většinu analýtů včetně maticově extrahovaných křivek; matrice efekty širokého rozsahu (přibližně 10–160 %), které byly kompenzovány použitím maticově extrahovaných standardů a izotopově značených interních standardů.
- Kvantitativní výkon: spike-in experimenty ukázaly dobrou přesnost a linearitu; mnohé lipidy vykazovaly konzistentní korektované recovery blízko 100 % a nízké CV v rámci validačních hladin.
- Omezení: cílený přístup založený na MRM je velmi citlivý a kvantitativní, ale omezený na předem definovaný panel analyzátů a nemusí plně rozlišit strukturální izomery bez dodatečných separačních technik (např. ion mobility nebo HRMS fragmentace).

Přínosy a praktické využití metody

- Vhodná pro velké kohortní nebo longitudinální studie lidského mléka díky krátké době analýzy (16 min) a vysoké průchodnosti.
- Umožňuje kvantifikaci širokého spektra lipidů včetně nízkokoncentrovaných signálních molekul relevantních pro výzkum výživy a vývoje imunitního systému dětí.
- Maticová kalibrace a použití mnoha izotopových interních standardů zvyšují spolehlivost výsledků při práci s heterogenními biologickými matricemi.

Budoucí trendy a možnosti využití

- Rozšíření panelu analyzátů a standardizace metodiky pro mezinárodní srovnatelnost dat v populačních studiích.
- Kombinace cíleného MRM přístupu s vysokorozlišovacími technikami a ion mobility pro lepší rozlišení izomerů a strukturálního info.
- Automatizace přípravy vzorků a implementace kvalitativních kontrol pro vysokoprodukční laboratoře a klinické studie.
- Integrace lipidomiky s dalšími 'omics' přístupy (metabolomika, proteomika, mikrobiomika) pro holistický pohled na dietu, vývoj a zdraví kojenců.

Závěr

Prezentovaný cílený LC–MS/MS workflow na triple kvadrupólu poskytuje citlivou, robustní a kvantitativně validovanou platformu pro rozsáhlé profilování lipidů v lidském mateřském mléce. Díky kombinaci rychlé UHPLC separace, rozsáhlého dynamického MRM panelu a maticově korektované kvantifikace je metoda vhodná pro epidemiologické studie i pro detailní sledování biomarkerů výživy a vývoje. Současná omezení týkající se rozlišení izomerů lze řešit kombinací s dalšími analytickými metodami.

Reference

1. Zhao H., Tummala M., Pandey G., Bode L. Targeted Lipidomic Analysis in Human Milk Using LC-MS/MS Triple Quadrupole. Poster ASMS 2026, WP 327.
2. Huynh K., et al. A Comprehensive, Curated, High-Throughput Method for the Detailed Analysis of the Plasma Lipidome. Agilent Application Note 5994-3747EN, 2021.