LC/MS Characterization of GLP-1 Receptor Agonist Oligomers and Other Elusive Impurities

Význam tématu

Charakterizace nečistot u peptidových léčiv, jako jsou agonisté receptoru GLP-1, je klíčová pro zajištění kvality, bezpečnosti a stability léčivých přípravků. Nečistoty vznikají při syntéze, během purifikace i při skladování a mohou zahrnovat oxidace, oligomerizaci, izomerizaci či neobvyklé modifikace N-terminu. Rychlé a spolehlivé metody LC/MS, které kombinují screeningové a hluboké sekvenační přístupy, zrychlují vývoj bioterapeutik a podporují rozhodování v oblasti formulace a kontroly kvality.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem prezentovaného workflow bylo demonstrovat kombinovaný přístup: rychlé prescreeningové zjištění nečistot pomocí dostupného single quadrupole detektoru s "mixed-mode" akvizicí a následné cílené detailní sekvenační zmapování pomocí Q-TOF MS/MS. Studie se zaměřila na liraglutid jako modelový peptid a sledovala impurity vzniklé nucenou oxidací i dlouhodobým skladováním.

Použitá metodika

Vzorkování a příprava:

• Vzorky 10 µM v 15 % acetonitrilu s 0,1 % kyselinou mravenčí.
• Generování nečistot: nucená oxidace 0,75 % H2O2; dlouhodobé skladování při 3 °C po 15 měsíců.

Chromatografie a MS strategie:

• Separace na sloupci Altura PeptidePlus chromatografického systému Agilent 1290 Infinity III Bio LC.
• Rychlý prescreening oxidací a nízkomolekulárních nečistot: InfinityLab Pro iQ Plus (single quadrupole) s mixed-mode akvizicí (full scan + SIM).
• Detailní sekvenační analýza a studium oligomerů: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF.
• Vysokom/z filtr: kvadrupól Q-TOF nastaven k přenosu pouze iontů > 1900 m/z, následné all-ions CID sledování monomerů v nízkém m/z pásmu pro analýzu disociace oligomerů.

Data a analýza:

• Software: OpenLab Acquisition 2.8, MassHunter Acquisition 11.0, MassHunter Qualitative Analysis 12.0, MassHunter BioConfirm 12.1, ExDViewer pro de novo sequencing tam, kde předpovězené nečistoty nepokryly pozorované signály.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity III Bio LC System (separace)
• Altura PeptidePlus kolona
• InfinityLab Pro iQ Plus single quadrupole mass detector (prescreening, mixed-mode akvizice)
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF (Q-TOF MS/MS, high m/z filtering, all-ions CID)
• Softwarové nástroje: OpenLab, MassHunter Qualitative, MassHunter BioConfirm, ExDViewer

Hlavní výsledky a diskuse

Oligomerizace a izomerie:

• Čerstvě připravený liraglutid rychle tvořil oligomery, zatímco jeho izomer v čerstvém stavu vykazoval minimální oligomerizaci. Po dlouhodobém skladování (15 měsíců) byly oligomery hojné u obou forem.
• Použití vysokého m/z filtru (>1900 m/z) a následného all-ions CID umožnilo sledovat monomerové "ejection" vzory bez rušení signály nižších m/z, čímž se zjednodušila interpretace složitých disociačních drah oligomerů.
• I když rychlosti uvolňování monomerů (pro 3+ a 2+ nábojové stavy) byly mezi formami podobné, výrazně se lišila míra sodiace (addukce sodíku) na ejected monomerech: při 60 V CE bylo sodiováno pouze ~1,8 % monomerů u liraglutidu oproti ~49 % u izomeru. To naznačuje konformační nebo povrchové rozdíly ovlivňující addukci sodíku a potenciálně i průběh oligomerizace.

Nečekaná N-terminální modifikace (+12 Da):

• Ve starších vzorcích byla nalezena hojnější neznámá nečistota o hmotnosti +12 Da relativně k liraglutidu, která nebyla v databázi. Pomocí netargetované dekonvoluce a generování "amino acid mass tags" byla modifikace lokalizována na N-terminus peptidu.
• Tento posun o 12 Da je konzistentní s dřívějšími zprávami o typu reakce mezi nečistotami excipientů a N-terminálním histidinem (přírůstek uhlíku), což podtrhuje důležitost kontroly kompatibility excipientů.

Oxidační nečistoty:

• Prescreening na Pro iQ Plus ukázal komplexní chromatografický profil s několika izomery oxidačních produktů. Mixed-mode (full scan + SIM) zvýšil detekční citlivost pro jednotlivé oxidační formy.
• Q-TOF MS/MS (CID) lokalizoval dioxygenovanou modifikaci na zbytkek tryptofanu na pozici 25 (W25), čímž byly identifikovány oxidační hotspoty v sekvenci.

Přínosy a praktické využití metody

• Komplementární workflow (rychlý SQ prescreen + cílený Q-TOF MS/MS) výrazně zkracuje čas nutný pro přiřazení a charakterizaci neznámých nečistot během vývoje bioterapeutik.
• Mixed-mode akvizice na dostupném single quadrupole zařízení poskytuje efektivní filtraci a citlivé sledování známých i očekávaných modifikací bez potřeby okamžitého použití vysokorozlišovacích přístrojů.
• High m/z filtrování a all-ions CID nabízejí účinný přístup k analýze oligomerů a jejich disociačních drah, zejména tam, kde překrývající se stavy a izoptopové distribuce komplikují interpretaci.
• Guided de novo sequencing a použití nástrojů pro generování aminokyselinových "mass tags" umožňují lokalizovat neočekávané modifikace, které nejsou v databázích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Širší integrace prescreeningových a vysoce výkonných MS metod do automatizovaných pipeline pro rychlé rozhodování ve vývoji formulací a stability.
• Použití dalších fragmentačních technik (např. ExD/ETD) a ion mobility separace pro lepší lokalizaci modifikací a rozlišení izomerů konformací.
• Vylepšení softwarových nástrojů pro de novo sekvencování a pokročilou dekonvoluci, zvláště pro složité směsi oligomerů a jejich aduktů.
• Zaměření na charakterizaci interakcí s excipienty a identifikaci reaktivních nečistot excipientů, aby se předešlo vzniku modifikací během skladování.

Závěr

Kombinace rychlého prescreeningu pomocí single quadrupole s následnou cílenou Q-TOF MS/MS analýzou poskytuje efektivní a robustní přístup pro identifikaci a detailní charakterizaci peptidových nečistot. Prezentované postupy ukázaly schopnost odhalit rozdílné oligomerizační chování, kvantifikovat rozdíly v addukci sodíku mezi izomery, lokalizovat oxidace a identifikovat neočekávanou N-terminální modifikaci o +12 Da. Tyto výsledky mají přímé využití v oblasti vývoje bioterapeutik, stability a kontroly kvality. Autor rovněž uvádí konflikt zájmu jako zaměstnanec výrobce použité instrumentace, což je důležité zohlednit při interpretaci výsledků.

Reference

1. Přáda Brichtová E.; Edu I. A.; Li X.; Becher F.; Gomes dos Santos A. L.; Jackson S. E. Effect of lipidation on the structure, oligomerization, and aggregation of glucagon-like peptide-1. Bioconjugate Chem. 2025, 36, 401–414.
2. Sheikh A. R.; Vitore J. G.; Bhalekar V. S.; Jain S.; Kukreja D.; Giri T.; Sharma N.; Benival D.; Shah R. P. Reactivity of N-terminal histidine of peptides toward excipients and excipient-related impurities: A case study of liraglutide excipient compatibility. J. Pharm. Sci. 2024, 113, 3246–3254.