Real-time Electron Capture Dissociation Characterization of Antibody Subunits via Microdroplet Reactions

Význam tématu

Hloubková charakterizace monoklonálních protilátek (mAb) pomocí hmotnostní spektrometrie je klíčová pro vývoj terapeutik, protože odhaluje kvalitativní atributy ovlivňující bezpečnost a účinnost. Zkrácení času analýzy a snížení artefaktů vznikajících při offline přípravě vzorků zvyšuje průchodnost a spolehlivost charakterizace, což je zásadní v prostředí rychlého vývoje biologických léků.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje kombinaci rychlých microdroplet reakcí, realizovaných v ionizačním zdroji Agilent Jet Stream (AJS), s elektronovým zachytávacím rozštěpením (ECD) pomocí ExD článku na Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF. Cílem bylo ukázat možnost „middledown“ analýzy trispecifické protilátky a jejích podjednotek: zrychlené chemické redukce disulfidů a enzymatická digesce v microkapkách následovaná ECD fragmentací pro získání sekvenční pokrytí.

Použitá metodika a instrumentace

Postup:

• Trispecifická protilátka byla odsolena a naředěna do 1 mg/mL v 5 mM amonném hydrogenkarbonátu.
• TCEP (10 mg/mL v 5 mM ammonium bicarbonate) a enzym GlySERIAS® (připravený na 1 unit/µL) byly připraveny v oddělených vialkách.
• Autosampler nasákl nejprve 5 µL reagentu/enzymu a následně 5 µL vzorku, vejde k promíchání v jehličce a pak byl směs injektována do průtoku vedoucího přímo do ionizačního zdroje.
• Po nasátí ve zdroji se iniciuje microdroplet reakce; v mikrokapkách probíhá redukce disulfidů (TCEP) a enzymatická štěpení v řádu mikrosekund až milisekund.
• Produkty byly sledovány v MS1 pro ověření účinnosti a poté byly izolovány cílové nabité stavy pro MS2 ECD analýzu.

Instrumentace:

• Agilent Infinity II 1290 Bio UPLC (použité režimy a podmínky injektoru jsou uvedeny v dokumentu v tabulkách LC podmínek).
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF vybavený ExD článkem (ExD cell) pro ECD fragmentaci.
• Agilent Jet Stream (AJS) ion source pro generování microdropletů a urychlení reakcí.
• Software ExDViewer pro analýzu ECD fragmentace a vyhodnocení sekvenčního pokrytí.
• Spotřební materiál: Amicon 10 kDa spin filtry, TCEP, GlySERIAS® enzyme (Genovis).

Poznámky k podmínkám: V původním dokumentu jsou podrobné LC a MS parametry rozvedeny v tabulkách; rovněž je uveden schématický nárys ExD článku a nastavení čoček/filamentu.

Hlavní výsledky a diskuse

Získané poznatky:

• Microdroplet redukce trispecifické protilátky s TCEP umožnila rychlé štěpení disulfidů při průchodu zdrojem; vybraný 15+ nabitý stav (m/z 1561.49) byl podroben ECD a dosáhl sekvenčního pokrytí cca 65 % (vyhodnoceno restriktivním skórováním v ExDViewer). Pokrytí zahrnovalo regiony mezi intra-chain disulfidy.
• Enzymatická microdroplet digesce GlySERIAS® provedená na scFv části vedla k řadě produktů způsobených variabilním štěpením [Gly4Ser]n tetheru; dekonvoluované spektrum ukázalo podobné produkty jako konvenční hodinová offline digesce, ale bez nutnosti inkubace.
• ECD analýza scFv produktů: izolovaný 12+ stav (m/z 2207.34) vykázal pouze ~27 % pokrytí. Nízké pokrytí koreluje s přítomností intaktních intra-chain disulfidických vazeb, které brání fragmentaci a dostupnosti sekvenčních iontů. Dodatečné pokusy s TCEP nezlepšily redukci těchto intra-chain vazeb za podmínek microdropletů.
• Další testované nabité stavy poskytovaly nižší pokrytí kvůli intenzitě prekurzoru nebo nižšímu nabití.

Diskuse:

• Kombinace microdroplet chemie a ECD fragmentace umožňuje rychlou „middledown“ charakterizaci s výrazným zkrácením doby přípravy vzorku ve srovnání s konvenčními offline protokoly.
• Nepřekonatelné intra-chain disulfidy zůstávají limitujícím faktorem pro kompletní sekvenční pokrytí při současných podmínkách microdroplet redukce; cílené úpravy redukčního postupu nebo kombinace s jinými redukčními/enzyma tickými strategiemi mohou být nutné pro úplnou mapu fragmentů.
• ExD cell ECD je účinný pro získání rozsáhlých sekvenčních informací u oblastí, kde jsou cystinová spojení již rozpojena.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody:

• Výrazné zkrácení doby potřebné pro redukci a digesci protilátek — microdroplet reakce eliminují hodinové inkubační kroky.
• Snížení rizika artefaktů spojených s delšími offline manipulacemi vzorků a možnost integrace do automatizovaných pracovních postupů LC–MS.
• Možnost rychlého screeningu kvality protilátek a jejich podjednotek v různých vývojových stádiích, což zvyšuje průchodnost laboratoří QC a R&D.

Omezení:

• Neúplné redukce některých intra-chain disulfidů v microdroplet podmínkách snižuje ECD pokrytí v určitých sekvenčních regionech.
• Vyšší závislost na volbě nabitého stavu prekurzoru pro optimalizovanou ECD fragmentaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

Směry dalšího vývoje:

• Optimalizace microdroplet redukčních podmínek (koncentrace, pH, kombinace redukčních činidel) za účelem účinnějšího rozrušení odolných intra-chain disulfidů.
• Integrace dalších enzymů a chemických reagencií pro rozšíření repertoáru rychlých online reakcí (např. selektivní štěpení, modifikace PTM) přímo v ionizačním zdroji.
• Vylepšení ExD/ECD technologie a softwarového vyhodnocení pro citlivější identifikaci slabě intenzivních fragmentů a lepší kvantitativní interpretaci pokrytí.
• Nasazení v rutině QC a high-throughput screeningových platformách pro rychlé kontroly kvality u biologických léčiv.

Závěr

Spojení microdroplet reakcí v Agilent Jet Stream zdroji s ECD fragmentací v ExD článku poskytuje efektivní workflow pro rychlou middledown charakterizaci protilátek. Metoda nabízí významné časové úspory a schopnost generovat ucelené sekvenční informace tam, kde jsou disulfidy adekvátně redukovány. Adaptace a optimalizace redukčních postupů a rozšíření enzymatických reakcí v microdropletech umožní rozšířit použitelnost této strategie pro komplexnější mapování strukturálních prvků protilátek.

Reference

1. Agilent Application Note 5994-6752EN.
2. Gunawardena HP, Ai Y, Gao J, Zare RN, Chen H. Rapid Characterization of Antibodies via Automated Flow Injection Coupled with Online Microdroplet Reactions and Native-pH Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 2023;95(6):3340–3348. DOI: 10.1021/acs.analchem.2c04535.
3. Yang Y, Xiao M, Lau J, Knierman M, Zhao H, Qiu X, Luo K, Sausen J, Gunawardena HP, Chen H. Ultrafast Microdroplet Digestion of Antibodies with Fc-Silencing Mutations. Analytical Chemistry. 2025;97(24):12813–12823. DOI: 10.1021/acs.analchem.5c01856.