Combining Microdroplet Reactions with ExD Fragmentation for Fast Characterization of Proteins and Antibody Subunits

Význam tématu

Monoklonální protilátky (mAb) představují klíčovou třídu biologických léčiv s rostoucím významem v terapii různých onemocnění. Detailní charakterizace jejich struktury a posttranslačních modifikací je zásadní pro zajištění bezpečnosti a účinnosti. Inovativní kombinace microdroplet reakcí s ExD fragmentací umožňuje výrazné zkrácení času analýzy a minimalizaci artefaktů vzniklých tradičními offline postupy.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl demonstrovat rychlou „middle-down“ charakterizaci intactních mAb a jejich podsložek pomocí microdroplet redukce v Agilent Jet Stream zdroji a následné elektron-zachytové disociační (ECD) fragmentace v ExD buňce. Výsledkem je vysoká sekvenční pokrytí i u obtížněřezatelných oblastí, například komplementárních determinačních regionů (CDR).

Použitá metodika a instrumentace

Metodika

• Příprava: NIST mAb v 5 mM NH₄HCO₃, 1 mg/ml, redukční činidlo DTT 10 mg/ml.
• Microdroplet redukce: smíchání vzorku a DTT v autosampleru (10 µl DTT + 5 µl mAb), okamžitá ionizace v microdropletech.
• Analýza: MS1 pro ověření redukce, cílená MS2 s izolací světlých a Fc subjednotek.
• Fragmentace: ExD bunka pro ECD, v některých případech doplněná CID energií 20 V.

Instrumentace

• Hmotnostní spektrometr: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF
• Kapalinová chromatografie: Agilent 1290 Infinity II Bio LC
• ExD buňka: nová generace pro ECD fragmentaci

Hlavní výsledky a diskuse

Microdroplet redukce proběhla v řádu mikrosekund s vysokou účinností, přičemž hlavní detekovaný produkt tvořila redukovaná světlá řetězce. Pomocí ECD fragmentace dosáhli výzkumníci 57% sekvenčního pokrytí světlé řetězce mAb, s téměř kompletní sekvencí oblasti CDR-L3. U offline digesí ½Fc fragmentu byla dosažena 33% pokrytí, přičemž disulfidové můstky ve středních oblastech zůstaly neporušené.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy intactních protilátek.
• Automatizovaný workflow minimalizuje manuální zásahy a riziko vzniku artefaktů.
• Vysoké sekvenční pokrytí i u obtížně sekvenovaných oblastech CDR.
• Možnost rozšíření na enzymatické digesce pro ještě hlubší charakterizaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace microdroplet enzymatických digesí pro komplexní middle-down a bottom-up analýzu.
• Využití pokročilých fragmentačních technik (např. UVPD) ve spojení s ECD pro rozšířené mapování modifikací.
• Automatizace a real-time monitoring pomocí softwarových řešení s umělou inteligencí.
• Nasazení v bioprodukční QC laboratořích pro rychlou kontrolu kvality léčiv.

Závěr

Demonstrace microdroplet redukce a ECD fragmentace na Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF potvrdila, že tento přístup umožňuje rychlou a spolehlivou middle-down charakterizaci mAb. Metoda nabízí vysokou sekvenční pokrytí, zejména v kritických oblastech CDR, a představuje perspektivní platformu pro automatizované a časově efektivní analýzy v biotechnologickém vývoji.

Reference

1 Agilent Application Note: 5994-6752EN