Flash Characterization of Antibodies via Microdroplet Reactions in an Unmodified Jet Stream Source

Význam tématu

Charakterizace monoklonálních protilátek je klíčová pro kontrolu kvality v biotechnologickém průmyslu a farmaceutickém výzkumu. Tradiční enzymatické štěpení a redukce disulfidových vazeb vyžadují desítky minut inkubace a vyšší spotřebu enzymů a vzorků. Aplikace mikrokapičkových reakcí v kapalinové elektrosprayové ionizaci (ESI) nabízí extrémně rychlou reakční kinetiku (mikrosekundy), vysoký výtěžek produktů a snížení nákladů a doby analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo optimalizovat workflow „Flash Characterization“ využívající mikrokapičkové reakce přímo v nepozměněném Jet Stream zdroji během flow injection analýzy (FIA). Studie se zaměřila na dvě klíčové reakce: štěpení IdeS enzymem a redukci disulfidových vazeb (TCEP, TEP, DTT). Optimalizované podmínky byly ověřeny na NIST IgG1 referenčním vzorku a následně aplikovány na řadu komerčních protilátek pro hodnocení robustnosti a univerzálnosti metody.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly připraveny ředěním protilátek i enzymů do roztoku 5 mM uhličitanu amonného. FIA v LC systému Agilent 1290 Infinity II (bez kolony) zajistila přenos směsi do Jet Stream ESI zdroje na QTOF spektrometru Agilent 6546.

• Mobile phase: 5 mM uhličitan amonný (optimální pH ~7)
• Flow rate: 25 µL/min (optimalizováno z 15–200 µL/min)
• IdeS:mAb poměr: 1:1 µL (0,5 U enzymu na 0,5 µg protilátky), vyšší poměr zvyšuje úplné štěpení
• ESI zdroj: Jet Stream, 365 °C sušící plyn, 60 psi nebulizér, 400 °C obalový plyn, kapilární napětí 5000 V
• MS parametry: rozsah m/z 1 350–10 000, 2 spektra/s, kladný režim

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace uhličitanové pufru ukázala, že 5 mM je nejlepší pro konverzi IdeS štěpení (>85 %) při průtoku 25 µL/min. Zvýšení poměru enzym:mAb zlepšilo úplné štěpení těžkých řetězců (97,6 kDa). Mikrokapičkové štěpení bylo prokázáno na 7 komerčních protilátkách s průměrnou konverzí 83–90 % a přesností do 8 %. Negativní kontrola (vedolizumab bez míst štěpení) prokázala specifitu IdeS.
Podobné účinnosti (85–87 %) vykázaly mikrokapičkové redukce disulfidů s TCEP, DTT i TEP. Reakce proběhly v mikrokapičkách během průtoku, bez nutnosti delších inkubací.

Přínosy a praktické využití metody

Flash Characterization umožňuje:

• Rychlou (mikrosekundy) a automatizovanou analýzu protilátek
• Výrazné snížení spotřeby enzymů a vzorků
• Integrované spojení s LC–MS bez následujících kroků přípravy
• Zvýšení throughput a snížení nákladů v QA/QC i výzkumu

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda může být rozšířena na:

• Další enzymatické modifikace (glykosylace, různé proteázy)
• Studium dynamiky komplexů a konformačních změn
• Integraci s vysokopropustnými screeningovými platformami
• Online reakce s dalšími analytickými technikami (ion mobility, HDX)

Závěr

Flash Characterization využívající mikrokapičkové reakce v nepozměněném Jet Stream zdroji představuje rychlou, efektivní a ekonomickou alternativu k tradiční enzymatické charakterizaci protilátek. Optimalizované podmínky (5 mM uhličitan amonný, 25 µL/min, IdeS i redukční činidla) poskytují vysokou konverzi a reprodukovatelnost napříč typy protilátek.

Reference

1. Gunawardena HP et al. Rapid Characterization of Antibodies via Automated Flow Injection Coupled with Online Microdroplet Reactions and Native-pH Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2023;95(6):3340–3348.