Increased sensitivity for low-input label-free proteomics using the Orbitrap Astral MS and μPAC Neo Plus Columns

Význam tématu

Úprava a analýza nízkoodběrových proteomických vzorků představuje klíčovou výzvu pro biologický výzkum i klinické aplikace, zejména při zpracování vzorků s omezeným množstvím materiálu (např. single‑cell, mikrodisekce). Label‑free kvantifikace založená na hmotnostní spektrometrii (LFQ) vyžaduje maximální citlivost, minimalizaci chybějících hodnot a stabilní kvantifikační výkonnost. Datově nezávislé pořizování dat (DIA) v kombinaci s vysoce citlivými analyzátory a vysoce efektivní nano‑chromatografií nabízí přístup ke zvýšení hloubky pokrytí proteomu právě u nízkých vstupů. Testovaná kombinace Orbitrap Astral Mass Spectrometer a mikro‑pilířkových (μPAC) Neo Plus kolon poskytuje nástroje pro zvýšení citlivosti a reprodukovatelnosti v LFQ workflows.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky bylo doložit schopnost identifikace peptideů a proteinů a kvantifikační přesnost při nízkých vstupech peptidů (50 pg–20 ng HeLa digest) pomocí DIA na Orbitrap Astral MS ve spojení s Vanquish Neo UHPLC a μPAC Neo Plus 50 cm kolonou. Studie porovnávala μPAC Neo Plus 50 cm s konvenční 75 μm I.D. × 25 cm pulled‑tip kolonkou; testovala přímou injekci i trap‑and‑elute workflow; analyzovala různé rychlosti zpracování (20–100 samples per day, SPD) a vliv FAIMS (jedno/dvě CV). Data byly zpracovány zejména ve Spectronaut 19.9.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Příprava: Pierce HeLa Protein Digest Standard rekonstituován v 0,02% DDM/0,1% kyselina mravenčí; sériové řady 50 pg–20 ng v náběhových objemech odpovídajících zvolenému workflow.
• Chromatografie: μPAC Neo Plus 50 cm (75 μm I.D.) provozovaná na Vanquish Neo UHPLC; porovnání s 75 μm × 25 cm packed‑bed pulled‑tip kolonkou (sub‑2 μm).
• Režimy: direct injection i trap‑and‑elute (backward flush) s různými loading objemy (0.05–7.5 µL).
• Rychlosti/gradienty: testy 20–100 SPD, v některých případech vícenásobné FAIMS CV pro zvýšení pokrytí.
• DIA optimalizace závislá na náloži: šířky izolačních oken (3–30 m/z) a maximální Astral injekční časy (7–80 ms) se upravovaly podle množství vzorku pro vyvážení citlivosti a složitosti spekter.

Použitá instrumentace (samostatná sekce):

• Thermo Scientific Orbitrap Astral Mass Spectrometer (Astral + Orbitrap kombinace)
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC System
• Thermo Scientific μPAC Neo Plus 50 cm HPLC Column a μPAC Trapping Column
• FAIMS Pro Duo Interface
• Thermo Scientific EASY‑Spray zdroj a ES993 emitter (10 μm I.D.)
• Sonation column oven pro μPAC (PRSO‑V2‑PF)
• Spotřební materiály: LC‑MS grade rozpouštědla, SureSTART mikrovíčka/skleněné lahvičky, DDM atd.
• Software: Spectronaut 19.9 (hlavní zpracování DIA), Proteome Discoverer, DIA‑NN (Aptila)

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání μPAC Neo Plus 50 cm vs 75 μm × 25 cm:

• Při vyšších vstupech (>2.5 ng) rozdíly v celkovém počtu peptidů byly malé (<6%).
• Při nízkých vstupech (<5 ng) μPAC prokázal výraznou výhodu: nárůst identifikací peptideů v rozsahu 6–33% a až do 35% více peptideů s CV <20% v porovnání s packed‑bed kolonkou.

Dopad optimalizace DIA parametrů:

• Load‑dependent nastavení izolačních oken a injekčních časů Astral analyzátoru zlepšilo linearitu a citlivost přes široké rozmezí náložení (50 pg–20 ng).
• Pro nízké nálože jsou výhodné delší injekční časy a širší okna pro zvýšení signálu; u vyšších náložení fungují lépe kratší časy a užší okna pro zachování selektivity.

Vliv FAIMS:

• FAIMS s odstraňováním singly nabitých rušivých iontů snižuje spektrální komplexitu a zvyšuje citlivost.
• Použití dvou FAIMS CV (s delšími gradienty) zvýšilo počet peptideů přibližně o 37% a počet proteinových skupin o cca 5% oproti jedné CV.

Throughput a reprodukovatelnost:

• Testy 20–100 SPD se 250 pg HeLa ukázaly, že optimální identifikace byly dosaženy při 30–50 SPD (nejvyšší počty: >49 000 peptideů a >6 300 proteinů při vhodných podmínkách).
• Proteinové skupiny vykazovaly median CV v rozmezí 13.5–15% napříč 20–100 SPD, což indikuje stabilní kvantifikační výkon i při vysoké propustnosti.

Trap‑and‑elute workflow:

• Umožňuje rychlé naložení a desalting objemů (rychlejší manipulace až 3 min) a flexibilitu při větších injekcích, s mírným rozšířením šířek peaků.
• Při středních naloženích (0.05–0.25 µL) byly výsledky podobné jako u přímé injekce; velký objem 7.5 µL vedl ke ~13% poklesu v počtu peptidů (pravděpodobně adsorpce vzorku ve vialu).
• Přidání 0.1% TFA při naložení mírně zúžilo peaky (~8%) za cenu 2–4% snížení identifikací (pravděpodobné ion‑suppressivní účinky).

Přínosy a praktické využití metody

• Kombinace Orbitrap Astral MS a μPAC Neo Plus 50 cm přináší citelně vyšší citlivost pro nízkoodběrové vzorky, což je klíčové pro single‑cell nebo draze získávané materiály.
• Load‑dependent optimalizace DIA parametrů maximalizuje využití dynamického rozsahu Astral analyzátoru napříč různými vstupy.
• FAIMS zvyšuje selektivitu a pokrytí proteomu; použití více CV je vhodné pro hloubkové studie, i když s nižším throughputem.
• Trap‑and‑elute přidává flexibilitu pro větší injekční objemy a automatizované workflows v rutinních vysokopropustných aplikacích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace μPAC technologie a vysoce‑citlivých analyzátorů (Astral) bude směřovat k běžnému nasazení pro single‑cell proteomiku a klinické mikroanalýzy.
• Pokročilá optimalizace DIA strategií (dynamické okna, adaptivní injekční časy) ve spojení s AI‑poháněným zpracováním dat (např. lepší library‑free přístupy) zvýší identifikace a kvantitativní přesnost.
• Vývoj automatizovaných trap‑and‑elute a micro‑sampling rozhraní sníží ztráty vzorku a minimalizuje adsorpci při velkých ředěních.
• Rozšiřování FAIMS strategií (více CV, optimalizace pro typy vzorků) a kombinace s orthogonálními separacemi pro komplexní biologické matrice.

Závěr

Technická poznámka potvrzuje, že spojení Thermo Scientific Orbitrap Astral MS s μPAC Neo Plus 50 cm kolonkou a vhodně optimalizovaným DIA protokolem významně zlepšuje citlivost a hloubku pokrytí proteomu u nízkých vstupů. μPAC přináší zejména výhodu při sub‑ng náložích, zatímco FAIMS a load‑dependent DIA parametry dále zvyšují výkon. Trap‑and‑elute nabízí praktickou alternativu pro rychlé naložení větších objemů při zachování konkurenceschopných identifikací. Celkově je workflow vhodné pro aplikace požadující vysokou citlivost, reprodukovatelnost a variabilní propustnost.

Reference

1. Hebert AS, Prasad S, Belford MW, Bailey DJ, McAlister GC, Abbatiello SE, Huguet R, Wouters ER, Dunyach JJ, Brademan DR, Westphall MS, Coon JJ. Comprehensive single‑shot proteomics with FAIMS on a hybrid Orbitrap mass spectrometer. Analytical Chemistry. 2018;90(15):9529–9537.
2. Thermo Fisher Scientific. Thermo Scientific μPAC Neo Plus HPLC columns: Use and care instructions (Instruction Sheet DOC018). 2025.
3. Frankenfield AM, Ni J, Ahmed M, Hao L. Protein contaminants matter: Building universal protein contaminant libraries for DDA and DIA proteomics. bioRxiv. 2022;2022.04.27.489766.
4. Renuse S, Damoc E, Arrey TN, Salvato F, Delanghe B, Webb S. Deeper proteome coverage and faster throughput for low input samples on the Orbitrap Astral mass spectrometer (Technical Note TN002255). Thermo Fisher Scientific. 2023.