Enhanced sensitivity of the Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer for deeper proteome coverage in single-cell proteomics

Význam tématu

Single-cell proteomika otevírá nové možnosti analýzy heterogenity buněk na úrovni jednotlivých proteomů, což je klíčové pro pochopení biologických procesů, vývoje nádorů, imunologických reakcí či vývoje organismu.
Nízké vstupní množství vzorku a potřeba vysoké citlivosti a reproducibility představují zásadní výzvy, jejichž řešení umožňuje hlubší vhled do variabilních buněčných stavů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit výkon nového Orbitrap Astral Zoom mass spektrometru v režimu Low Input pro library-free data-independent acquisition (DIA). Hodnoceny byly parametry hloubky pokrytí proteomu, kvantitativní přesnost, preciznost a propustnost analýzy vzorků s obsahem od 50 pg po jednotlivé buňky.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorků: HeLa digest standard, tří-proteomový mix (HeLa, kvasnice, E. coli) a jednotlivé HEK293F buňky na 384-well low-binding destičkách s lysis bufferem TEAB/TFE a následnou tryptickou digescí.
• Chromatografie: Vanquish Neo UHPLC systém, IonOpticks Aurora Ultimate C18 kolona (25 cm×75 µm, 1,7 µm), průtok 0,2 µL/min, teplota 50 °C, metoda 50 vzorků/den.
• Hmotnostní spektrometrie: Orbitrap Astral Zoom MS s FAIMS Pro Duo interfací a EASY-Spray NG zdrojem, High-resolution DIA (240 000@m/z 200), optimalizované izolační okno a injekční časy přizpůsobené množství vzorku.
• Analýza dat: Spectronaut 19.5 software s directDIA+ workflow, vyhodnocení bez nutnosti předchozí knihovny, filtrované FDR pro PSM, peptidy i skupiny proteinů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Orbitrap Astral Zoom vs. předchozí Astral MS: průměrný nárůst identifikovaných proteinových skupin o 6,8 % a peptidů o 20,8 % při 250 pg HeLa digestu.
• Diluce HeLa digestu (50–2 000 pg) přinesla až 7 992 proteinových skupin a 80 916 peptidů, CV proteinů v triplikátech <6,1 %.
• Tří-proteomový mix (100–5 000 pg) prokázal kvantitativní přesnost s relativní chybou <7,5 %, identifikace přes 12 700 proteinů a 121 600 peptidů při 5 000 pg dávce.
• Analýza 24 skutečných HEK293F buněk vedla k průměru 5 842 identifikovaným proteinovým skupinám a 34 538 peptidům na buňku, což je nejvyšší počet dosud publikačně dosažený pro tento typ vzorku.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost a propustnost (50 SPD) vhodná pro rutinní analýzu nízkovstupních a jednotlivých buněk.
• Robustní kvantifikace s nízkou biologickou a technickou variabilitou (CV <20 %).
• Metoda bez potřeby předchozí spektrální knihovny zjednodušuje workflow a zkracuje dobu analýzy.
• Široké využití v biomedicínském výzkumu, QA/QC v farmaceutických laboratořích a klinických studiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace automatizovaných postupů přípravy jednotlivých buněk a minimalizace ztrát vzorku.
• Rozšíření propustnosti na stovky vzorků denně při zachování citlivosti.
• Multimodální analýzy kombinující proteomiku s transkriptomikou nebo metabolomikou.
• Implementace pro klinickou diagnostiku, personalizovanou medicínu a screening malých buněčných populací.

Závěr

Implementace Orbitrap Astral Zoom MS v režimu Low Input spolu s library-free DIA přináší zásadní vylepšení citlivosti, přesnosti a throughputu pro analýzu nízkovstupních vzorků i jednotlivých buněk. Výsledné workflow nabízí robustní řešení pro široké spektrum aplikací v moderní proteomice.

Reference

1. Arrey TN, Pashkova A, et al. Deeper proteome coverage and faster throughput for single-cell samples on the Orbitrap Astral mass spectrometer. Thermo Fisher Sci. Tech. Note 002780, 2024.
2. Bubis JA, Arrey TN, Damoc E, et al. Challenging the Astral mass analyzer to quantify up to 5,300 proteins per single cell at unseen accuracy to uncover cellular heterogeneity. Nat Methods. 2025;22:510–519.
3. Tan E, Chin CSH, Lim ZFS, Ng SK. HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Front Bioeng Biotechnol. 2021;9:796991.