High-resolution DIA proteomics workflow for single-cell samples on the Orbitrap Astral mass spectrometer

Význam tématu

Proteomika jednotlivých buněk umožňuje odhalit buněčnou heterogenitu v komplexních biologických vzorcích. Rozvoj citlivých a vysoce propustných metod LC-MS je klíčový pro charakterizaci proteomu s velmi omezeným množstvím materiálu.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem studie bylo ověřit schopnost Orbitrap Astral hmotového spektrometru v režimu vysokého rozlišení a datově nezávislé akvizice (DIA) při analýze jedné až několika desítek HeLa buněk. Studie porovnává metodu bez využití knihovny (library-free) a metodu založenou na spektálním katalozích (library-based) z hlediska pokrytí proteomu, kvantitativní přesnosti, linearity a propustnosti.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorků: Cellenion cellenONE platforma pro izolaci a naložení jednotlivých HeLa buněk.
• Chromatografie: Vanquish Neo UHPLC systém s µPAC Neo 50 cm silikoniovým mikropilířkovým kolonem; optimální gradient 8 min pro 80 vzorků/den (SPD) s prodloužením cyklu na 20 min pro single-cell.
• FAIMS Pro Duo rozhraní pro redukci pozadí a zvýšení signál-šum poměru.
• Hmotový spektrometr: Orbitrap Astral kombinující Orbitrap pro full scany (240 000 rozlišení) a Astral analyzátor pro rychlé a senzitivní MS/MS skeny.
• Data processing: Spectronaut 18 (directDIA, Pulsar), Proteome Discoverer 3.1 (CHIMERYS).

Hlavní výsledky a diskuse

V dávkovém testu rozředění HeLa peptidů z rozsahu 50 pg až 5 ng bylo kvantifikováno 2 700 až 6 650 proteinových skupin. Metoda vykazuje vysokou přesnost (CV < 10 %) a lineární odezvu až pro poměry 1:100. U analýzy jednotlivých buněk bylo identifikováno v library-free režimu průměrně 3 400 proteinových skupin a 15 300 peptidů; zpracování všech dat souběžně zvýšilo pokrytí na 4 250 skupin. Využití knihovny ze 20 buněk posunulo hranici až na 5 400 proteinových skupin.

Přínosy a praktické využití metody

• Hluboká charakterizace proteomu i u minimálních vzorků až na úrovni jediné buňky.
• Vysoká propustnost (72–80 vzorků/den) při zachování citlivosti.
• FAIMS Pro zlepšuje kvalitu spekter snížením pozadí a šumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zvyšování citlivosti a rychlosti analýz, rozšíření metodiky na multiomické přístupy a automatizované vysokovýkonné platformy pro široké spektrum biologických a klinických aplikací.

Závěr

Orbitrap Astral hmotový spektrometr v kombinaci s Vanquish Neo UHPLC a µPAC kolonu představuje nový standard pro single-cell proteomiku, nabízející hluboké pokrytí, vynikající kvantitativní výkonnost a vysokou propustnost.

Reference

• Arrey TN, Damoc E, Delanghe B, Salvato F, Kraegenbring J, Pekar Hart T. High-resolution DIA proteomics workflow for single-cell samples on the Orbitrap Astral mass spectrometer. Thermo Fisher Scientific, Technical Note TN003329; 2024.
• Spectronaut 18 Software; Biognosys AG.
• Proteome Discoverer 3.1 Software; Thermo Fisher Scientific.