Predictable Isolation of Radioligand Therapy Precursor PSMA-617 and Closely Eluting Impurities from a Forced Degradation Study Using a MaxPeak™ Premier OBD™ Preparative Column

Význam tématu

Radioligandová terapie představuje rostoucí oblast cílené onkologie, kde je klíčové mít k dispozici vysoce čisté prekurzory a standardy pro vývoj, kontrolu kvality a další charakterizaci. PSMA-617, prekurzor léčiva PLUVICTO®, obsahuje chelátovací část náchylnou k nespecifické adsorpci na kovové povrchy, což komplikuje chromatografické rozdělení a čistíci procesy. Prediktabilní a škálovatelná preparativní chromatografie s inertními povrchy tak zkracuje čas isolace, minimalizuje ztráty látky a vytváří materiál vhodný jako referenční standard pro další studie.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo opakovat forced degradation PSMA-617 ve větším měřítku a demonstrovat praktickou, prediktabilní strategii pro izolaci hlavního prekurzoru od těsně elujících nízkoúrovňových degradantů. Hlavní požadavky byly zachovat analytickou selektivitu při škálování na preparativní kolonu, minimalizovat nespecifickou adsorpci (NSA) a dosáhnout čistého PSMA-617 vhodného jako referenční materiál.

Použitá instrumentace

• Waters AutoPurification System s 2998 Photodiode Array detektorem (UV, 254 nm) pro řízený preparativní sběr frakcí
• ACQUITY UPLC H-Class System s ACQUITY UPLC TUV detektorem a QDa (Mass) detektorem pro analytickou kontrolu a identifikaci
• XSelect Premier CSH Phenyl‑Hexyl analytická kolona 2.1 x 100 mm, 2.5 µm
• MaxPeak Premier XSelect CSH Phenyl‑Hexyl OBD preparativní kolona 10 x 150 mm, 3.5 µm (inertní hardware, HPS Technology)
• Timberline column heater pro kontrolu teploty kolony při preparativní práci
• Software: MassLynx v4.2, Empower 3, Application manager FractionLynx

Použitá metodika

Vzorek: PSMA-617 v koncentraci 5 mg/mL ve vodě; tři 4 mL alikvoty degradovány separátně za použití: 1 N HCl (kyselé), 1 N NaOH (základité) a 3 % H2O2 (oxidační), každá při 70 °C po dobu 24 hodin. Všechny tři reakční směsi byly sloučeny pro analýzu a purifikaci.

Chromatografie: Reverzně-fázová eluce s mobilem A = voda + 0,1 % kyseliny mravenčí, B = methanol + 0,1 % kyseliny mravenčí. Analytické metody zahrnovaly scouting gradient (5–95 % B) následovaný dvěma „focused“ gradenty a optimalizací startovacího procenta a rozsahu (finální focused gradient 45–54 % B). Analytické běhy: 2 µL injekce, 0,35 mL/min, kolona 2.1 x 100 mm, 2.5 µm; preparativní škálování: 68 µL injekce, 5,67 mL/min, kolona 10 x 150 mm, 3.5 µm. Poměr L/dp (délka k průměru částice) byl zachován pro přímou škálovatelnost (≈40 000 analytika vs. ≈42 857 preparativně).

Hlavní výsledky a diskuse

Rozbor chromatogramů ukázal, že původní scouting gradient odhalil minimálně dvě znečišťující špičky těsně elující kolem hlavního PSMA-617 píku. Úprava na focused gradient (45–54 % B) poskytla potřebné rozlišení mezi hlavním píkem a předcházející/podcházejícími impurity.

Na preparativním stupni s MaxPeak Premier OBD kolonnou (HPS technologie) byla zachována analytická selektivita a rozlišení. Frakční sběr pod vedením UV a ověření ESI+ MS umožnily identifikovat následující komponenty:

• Peak 1: malý přední raménko obsahující PSMA-617 (m/z 1042 [M+H]+ a 521 [M+2H]2+) a dva degradanty (m/z 371 a 741)
• Peak 2: hlavní PSMA-617 (potvrzeno podle m/z 1042 a 521)
• Peaks 3–5: tři pozdně elující neznámé impurity sdílející m/z 1024 a 512 (pravděpodobně související struktury)

Řízením parametrů frakční kolekce bylo dosaženo vysoce čistého PSMA-617; analytická kontrola frakcí (rychlý screening i focused gradient) ukázala jediný pik s m/z odpovídající PSMA-617. Dvě bezprostředně následující impurity byly izolovány a výrazně obohaceny (target-enriched), avšak ne zcela vyčistěny — vhodné pro následný „polishing“ krok, který by pravděpodobně vedl k jejich úplné izolaci.

Význam HPS (inertního) povrchu a menších částic v preparativní koloně se projevil v lepších plošných výnosech, ostřejších píkech a nižším tailingu, což snížilo NSA a zlepšilo spolehlivost spouštění frakcí. Zachování podobného L/dp umožnilo přímou prediktabilní škálovatelnost z UHPLC na preparativní úroveň.

Přínosy a praktické využití metody

• Prediktabilní škálovatelnost analytika→prep: usnadňuje přenos metody z vývoje do purifikačního workflow bez složité redistribuce selektivity.
• Redukce NSA díky HPS/inertnímu hardwaru: snižuje ztráty peptidických/chelátujících sloučenin a eliminuje potřebu dlouhého kondicionování kolony.
• Zvýšená efektivita separace: 3.5 µm packing přináší lepší rozlišení těsně elujících impurit při příznivých průtocích pro preparativní práci.
• Úspora času a materiálu: menší frakce znamenají rychlejší sušení a snazší následné zpracování; vhodné pro systémy s časově omezenými radionuklidy.
• Praktické využití ve vývoji radioligandů, kde je potřeba referenčních standardů a charakterizace degradantů pro regulační dokumentaci.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace MS‑řízených strategií pro frakční sběr a online identifikaci (zvýšení throughputu a selektivity při purifikaci často se měnících degradačních profilů).
• Vývoj kompaktních, high-throughput prep kolonek s inertním povrchem pro práci s radioaktivními prekurzory s krátkou poločasem rozpadu.
• Větší automatizace a opakovatelnost procesů v purifikačních labouratořích pro rychlé generování referenčních materiálů a polotovarů pro strukturální elucidaci.
• Standardizace škálovacích pravidel (L/dp, lineární rychlost, měřítko dávky) specificky pro peptidické/chelátující radioligandy, včetně doporučení pro minimalizaci NSA.
• Využití kombinace HPS povrchů a nových stacionárních fází (např. hybridních nebo nabitých částic) k dosažení alternativní selektivity a lepší separace izomerů či modifikovaných produktů degradace.

Závěr

Studie demonstrovala, že použitím XSelect CSH Phenyl‑Hexyl stacionární fáze na inertním MaxPeak Premier OBD preparativním sloupci a optimalizovanými focused gradienty lze prediktabilně izolovat PSMA-617 z nuceně degradovaného vzorku s vysokou čistotou. Zachování podobného L/dp při škálování umožnilo přímé přenesení analytické separace na preparativní úroveň. HPS technologie snížila NSA a zlepšila tvar píku, což umožnilo přesné řízení frakčního sběru a efektivní obohacení vedlejších degradantů pro další purifikaci a identifikaci. Celkově kombinace stacionární fáze, inertního hardwaru, small-particle packingu a pečlivě zvoleného gradientu poskytuje robustní workflow vhodné pro potřeby purifikačních laboratoří v oblasti radioligandových terapeutik.

Reference

1. Giugliano F, et al. Cancer Treatment Reviews. 136 (2025) 102940.
2. Berthelette K, Aiello M, Collins C, Walter TH. Development of a UPLC Method for a Forced Degradation Study of Radioligand Therapy Precursor PSMA-617. Waters Application Note. 2025.
3. DeLano M, et al. Analytical Chemistry. 93 (2021) 5773–5781.
4. Xia J, Jablonski J, Shave D, Lawrence K. Temperature Control Using Waters LC Purification Systems with Timberline’s Column and Mobile Phase Heaters: Optimizing Preparative Performance. Waters Application Brief. 2025.
5. Fountain K, Hewitson H, Iraneta P, Morrison D. Practical Applications of Charged Surface Hybrid (CSH) Technology. Waters Application Note. 2010.
6. Jablonski J, Wheat T, Diehl D. Developing Focused Gradients for Isolation and Purification. Waters Application Note. 2009.
7. Jablonski J. 5 Rules of Scaling LC Purification. Waters Article. 2024.