Development of a LC-UV Method for Separating 12 Steroids using a Waters Acquity™ Biphenyl RP Column with MaxPeak™ Technology

Význam tématu

Kontrolované a reprodukovatelné separace steroidů jsou zásadní v klinické diagnostice, farmaceutickém vývoji a kvalitativní/kvantitativní analýze látek s podobnou strukturou. Steroidy často obsahují isobarické páry a polarní deriváty (např. fosfáty), které se obtížně rozlišují běžnými chromatografickými přístupy. Efektivní LC‑UV metoda s dobrou selektivitou, krátkým cyklem a vysokou zotavitelností analyzátů proto významně zjednodušuje rutinní analýzy a zvyšuje spolehlivost výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem byla příprava a optimalizace reverzně-fázové LC‑UV metody pro škálovatelnou separaci směsi 12 steroidů (včetně steroidního fosfátu) tak, aby byly rozlišené tři dvojice izobarů a zároveň minimalizován čas analýzy a zajištěna vysoká zotavitelnost polárního fosfátového analytu. Autoři použili strukturovaný screening šesti rozdílných stacionárních fází a porovnali dvě silné organické fáze (acetonitril a methanol). Metodika dále zahrnovala optimalizaci teploty, gradientu a test vlivu inertního MaxPeak Premier (HPS) slínku proti konvenčnímu nerezovému slínku.

Použitá metodika a instrumentace

Obecný přístup:

• Příprava pracovní směsi: jednotlivé standardy 1 mg/mL, směs obsahovala 50 µg/mL každého analyzátu; vzorek v přibližném složení 31:69 v/v acetonitril:voda.
• Scouting: šest sloupců se screenovalo stejným nízkopH mobilním fázím modifikovaným kyselinou mravenčí; silné eluentní fáze byly acetonitril nebo methanol.

Použitá instrumentace (souhrn a hlavní parametry):

• LC systém: Waters ACQUITY Premier (QSM) s PDA detektorem; software Empower pro řízení a zpracování dat.
• Detekce: UV při 275 nm.
• Kolony (2.1 × 50 mm, elementy 1.6–1.8 µm): BEH C18, CSH Phenyl‑Hexyl, HSS PFP, BEH Biphenyl (Waters Acquity Biphenyl RP), BEH Phenyl, CORTECS C8; všechny v konfiguraci kompatibilní s MaxPeak Premier povrchem, u porovnání byl také použit stejný BEH Biphenyl plněný do nerezové (stainless‑steel) hardware.
• Podmínky: teplota kolony 30 °C (optimalizováno na 35 °C), teplota vzorku 10 °C, průtok 0.4 mL/min, objem injekce 5 µL.
• Mobilní fáze: voda (A), acetonitril (B), methanol (C), 2 % kyselina mravenčí (D); během scouting běžela konstantní 5 % D (odpovídá ~0.1 % kyseliny v konečné směsi).

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky screeningu:

• Při použití methanolu jako silné fáze byla retence obecně vyšší a separace mnoha párů nevhodná (problémy s koelucí).
• Acetonitril poskytl nižší retenci a lepší selektivitu; nejlepší výkonnost vykázaly HSS PFP a především BEH Biphenyl, přičemž BEH Biphenyl zajišťoval baseline separaci všech 12 komponent a zvláště zlepšené rozlišení kritických párů (komponenty č. 2 a 10, 7 a 8, 11 a 12).

Optimalizace separace a doby běhu:

• Pro rozeznání neznámé nečistoty, která ko‑elutovala s komponentou 11, byla provedena optimalizace teploty; zvýšení teploty z 30 °C na 35 °C vedlo k dostatečnému rozlišení; 40 °C přineslo jen marginální zlepšení, takže 35 °C zůstalo kompromisem mezi rozlišením a stabilitou.
• Analýza byla zrychlena úpravou počátečního % organiky a zkrácením koncového bodu gradientu: počáteční obsah organiky byl zvýšen z 5 % na ~30 % (výchozí 35 % vedl k eluci prvního píku velmi blízko průchodu), konečný obsah acetonitrilu snížen na ~60 %; současně byl použit pozvolnější gradientní sklon pro lepší separaci kritických párů. Tím se výrazně zkrátil celkový cyklus bez ztráty rozlišení.

Vliv hardware kolony (MaxPeak Premier HPS vs nerez):

• Při použití nerezového hardware se betamethasone‑fosfát výrazně nesledoval (prakticky nedetekovatelný), což indikuje adsorpci nebo ztráty na kovových površích.
• MaxPeak Premier hardware (s úpravou povrchu) udržel zotavení a selektivitu fosfátového analytu; navíc se projevily drobné posuny retencí u impurity při použití nerezového slínku, které vedly ke částečné ztrátě separace s komponentou 11. To potvrzuje, že inertní povrch kolony může zásadně ovlivnit citlivost a reprodukovatelnost analýzy polárních/ionizovatelných steroidů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda poskytuje:

• Baseline separaci 12 steroidů v krátkém cyklu vhodném pro rutinní analýzy v klinických i farmaceutických laboratořích.
• Robustní detekci a zotavení steroidního fosfátu díky použití inertního MaxPeak Premier hardware, což minimalizuje chyby způsobené adsorpcí na kovových površích.
• Snadnou přizpůsobitelnost: optimalizace gradientu a teploty umožňuje kompromis mezi rychlostí a selektivitou podle konkrétních požadavků.

Praktické aplikace zahrnují kvantitativní panelové stanovení steroidů pro diagnostiku, sledování farmakokinetiky, testování čistoty a identifikaci nečistot v during vývoji léčiv a kontrole kvality.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry a potenciální rozšíření této práce:

• Integrace s hmotnostní spektrometrií (LC‑MS) pro zlepšení selektivity a potvrzení identit izobarických párů; metoda LC‑UV může sloužit jako rychlý skrínink před cíleným MS vyhodnocením.
• Další vývoj povrchových úprav hardware kolony a komponent systému (HPS a další inertní technologie) pro zvýšení zotavení pro více polarních a ionizovatelných látek.
• Automatizované, algoritmické plánování metod (AI‑řízené screeningy stacionárních fází a gradientů) pro rychlejší nalezení optimálního kompromisu mezi časem, rozlišením a citlivostí.
• Rozšíření panelů o metabolity a konjugáty steroidů, které vyžadují odlišné chromatografické strategie (např. hydrophilic interaction chromatography, derivatizace).

Závěr

Strukturovaný screening několika separačních fází prokázal, že BEH Biphenyl (s acetonitrilem jako silnou fází) poskytuje nejlepší celkové rozlišení pro směs 12 steroidů, včetně tří párů izobarů. Optimalizace teploty a gradientu umožnila kratší a účinný analytický běh. Kritickým zjištěním je nutnost použití inertního MaxPeak Premier hardware pro spolehlivé zjištění a zotavení steroidního fosfátu; nerezové slínko vedlo ke ztrátě signálu a změnám retencí. Celkově metodika ilustruje hodnotu kombinace pečlivého výběru stacionární fáze, optimalizovaného gradientu a inertního hardware pro robustní rutinní analýzy steroidů.

Reference

1. Hong P, McConville P. A Complete Solution to Perform a Systematic Screening Protocol for LC Method Development. Waters White Paper. 720005268.
2. Maziarz M, McCarthy S, Wrona M. Improving Effectiveness in Method Development by Using a Systematic Screening Protocol. Waters Application note. 720005026.
3. Berthelette K, Collins C, Kalwood J, Haynes K. Using the Systematic Screening Protocol and MaxPeak Premier Columns to Separate Seven Janus Kinase Inhibitors. Waters Application note. 720008528.
4. DeLano M, Walter TH, Lauber MA, Gilar M, Jung MC, Nguyen JM, Boissel C, Patel AV, Bates‑Harrison A, Wyndham KD. Using Hybrid Organic‑Inorganic Surface Technology to Mitigate Analyte Interactions with Metal Surfaces in UHPLC. Analytical Chemistry. 2021;93:5773–5781.
5. Berthelette K, DeLoffi M, Collins C, Kalwood J, Walter TH. Correlation Between the Adsorption of Acidic Analytes on Stainless Steel Columns and Their Ionic Charge. Waters Application note. 720008792.
6. Walter TH et al. Modifying the Metal Surfaces in HPLC Systems and Columns to Prevent Analyte Adsorption and Other Deleterious Effects. LCGC Supplement. 2022:28–34.
7. Berthelette K, Aiello M, Collins C, Walter TH. Development of a UPLC Method for a Forced Degradation Study of Radioligand Therapy Precursor PSMA‑617. Waters Application note. 720009042.
8. Tanna N, Plumb R, Mullin L. Improvements in Sensitivity for Quantification of Steroid Phosphate Drugs Using ACQUITY Premier System and ACQUITY Premier Columns. Waters Application note. 720007095.
9. Zabala G et al. A Highly Stable Biphenyl HPLC Stationary Phase Based on Ethylene‑Bridged Hybrid Particles. Waters Application note. 720009261.