Purification of Chicoric Acid from Echinacea Tea Using a Waters MaxPeak™ Premier OBD™ Preparative Column

Význam tématu

Izolace a purifikace přírodních produktů v malém měřítku je v laboratořích pro podporu objevování léčiv a rychlé ověřování biologických aktivit stále častější. Metody, které zvyšují citlivost, zlepšují tvar píku a zároveň snižují spotřebu organických rozpouštědel a čas analytických i preparativních sekvencí, jsou proto vysoce žádané. V tomto kontextu je důležité omezit nespecifické adheze kyselých sloučenin (např. karboxylových, sulfátových, fosfátových) na kovové povrchy v chromatografickém systému, protože tyto interakce snižují výtěžnost a kvalitu frakcí.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat vhodnost inertních MaxPeak Premier OBD preparativních sloupců (HSS T3) pro izolaci chicorové kyseliny z echinaceového čaje. Studie srovnává analytické UPLC rozdělení na ACQUITY Premier HSS T3 s konvenčními nerezovými sloupci a následně škáluje metodu na dvě preparativní kolony s odlišnými velikostmi částic (5 μm, 10 × 150 mm a 3.5 μm, 10 × 100 mm) za účelem vyhodnocení účinnosti, spotřeby rozpouštědel a kvality získaného materiálu.

Použitá instrumentace

• Waters AutoPurification System (prep)
• ACQUITY UPLC H-Class System (analytika)
• Detektory: 2998 PDA (AutoPurification), ACQUITY UPLC TUV (H-Class); detekční vlnová délka 254 nm a 330 nm (330 nm použit pro snížení interferencí)
• Kolony: ACQUITY Premier HSS T3, 2.1 × 50 mm, 1.8 μm; XSelect Premier HSS T3 OBD Prep Column 5 μm, 10 × 150 mm (custom); XSelect Premier HSS T3 OBD Prep Column 3.5 μm, 10 × 100 mm (custom)
• Software: MassLynx v4.2, FractionLynx

Použitá metodika

• Příprava vzorku: extrakce 4 pytlů citron‑echinacea čaje vodou (celkem ~300 mL extraktu po filtraci a promytí).
• Mobilní fáze: A = voda + 0,1 % kyseliny formiové; B = methanol + 0,1 % kyseliny formiové.
• Analýza a optimalizace na analytické kolonce 2.1 × 50 mm, 1.8 μm; inj. 5 μL; použit byl „focused“ gradient (32–40 % B) pro zvýšení rozlišení chicorové kyseliny od blízce elujících nečistot (detekce na 330 nm).
• Škálování na preparativní kolony s obdobným L/dp poměrem (analytika L/dp ≈ 2.78 × 10^4; prep 5 μm L/dp = 3.00 × 10^4; prep 3.5 μm L/dp = 2.86 × 10^4).
• Preparativní provozní parametry: průtok prep stanoven jednotně na 5.4 mL/min (i když striktně škálované hodnoty by byly ~2.85 a 4.08 mL/min), injekční objemy: 340 μL pro 10 × 150 mm (5 μm) a 227 μL pro 10 × 100 mm (3.5 μm).
• Vyhodnocení: porovnání plochy a výšky píků, doby běhu, objemu frakcí, následná analýza sdružených frakcí UPLC na kvalitativní čistotu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Inertní povrch MaxPeak Premier (HPS) redukuje nespecifickou adsorpci negativně nabitých skupin na kovových površích. Na analytické úrovni byla plocha píků chicorové kyseliny přibližně o 7 % vyšší a výška píků o ~2 % vyšší na Premier sloupci ve srovnání s konvenční nerezovou kolonkou.
• Preparativní izolace na 5 μm kolonce kopírovala analytickou separaci, potvrzující predikovatelné škálování díky OBD (Optimum Bed Density) balení.
• S použitím 3.5 μm 10 × 100 mm kolony se dosáhlo stejné UV čistoty izolovaného chicorátu jako s 5 μm 10 × 150 mm kolonkou, přičemž metoda byla rychlejší: celkový čas metody byl u 3.5 μm o 16,28 minuty kratší (asi 34 % úspora času v porovnání s 5 μm konfigurací podle úvodního tvrzení) a zaměřená část gradientu byla kratší o >6,5 minuty.
• Spotřeba rozpouštědla byla snížena přibližně o 88 mL na běh při použití 3.5 μm vs 5 μm při stejném průtoku 5.4 mL/min, což snižuje náklady i objem odpadu.
• Průměrný objem frakce chicorové kyseliny z 3.5 μm kolony byl přibližně o 10 % menší než z 5 μm kolony, což urychluje následné sušení/lyofilizaci frakcí.
• Při nízkých dávkách (injekce 34 μL) většina sledovaných píků vykázala vyšší plochu a výšku na MaxPeak Premier preparativní kolonce ve srovnání s nerezovým ekvivalentem, což zlepšuje možnost detekce a sběru stopových či nízkomnožstevních látek.

Přínosy a praktické využití metody

• Inertní povrch kolon: vyšší citlivost a lepší tvar píků pro kyselé přírodní látky, lepší spolehlivost spouštění frakcí a vyšší recovery.
• OBD balení a obdobné L/dp: přímé a predikovatelné škálování z UPLC na preparativní úroveň.
• Menší částice (3.5 μm): kratší analytické i preparativní časy, nižší spotřeba rozpouštědel, menší objemy frakcí a rychlejší sušení, což zvyšuje produktivitu a udržitelnost pracovních postupů.
• Vhodné pro izolaci snížených množství cílových látek v objevech a pro rychlé screeningové purifikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření inertních povrchů a optimalizace systémových materiálů pro snížení NSA u širšího spektra polárních a kyselých analyzovaných sloučenin.
• Integrace rychlých postupů s mini‑prep pracovními toky pro high‑throughput purifikace (96/384‑well formáty) s cílem maximalizovat výnosy při minimálních množstvích vzorku.
• Pokročilá škálovatelnost: kombinace OBD technologie se sofistikovanými modely škálování umožní přesnější predikci chování při přechodu mezi více velikostmi částic a délkami kolon.
• Ekologická optimalizace: další snižování spotřeby organických rozpouštědel a zavádění „green“ rozpouštědel při zachování rozlišení a výtěžnosti.

Závěr

Použití MaxPeak Premier HSS T3 OBD preparativních kolon pro izolaci chicorové kyseliny z echinaceového čaje prokázalo několik praktických výhod: inertní povrch snižuje ztráty způsobené adsorpcí kyselých látek, OBD balení zajišťuje predikovatelné škálování z UPLC do preptieru a menší částice (3.5 μm) zrychlují separaci, šetří rozpouštědlo a zmenšují objemy frakcí bez kompromisu na čistotě produktu. Tyto vlastnosti činí popsaný přístup vhodným pro rychlé, efektivní a udržitelné purifikace v prostředí objevné a analytické chemie.

Reference

1. Sunset Editors. Sunset Western Garden Book, 1995; s. 606–607.
2. Flora of North America (FNA), Vol 21, s. 43,64,65,88.
3. Jahanian E., Jahanian R., Rahmani H., Alikhani M. Dietary Supplementation of Echinacea purpurea Powder Improved Performance, Serum Lipid Profile, and Yolk Oxidative Stability in Laying Hens. J. Appl. Anim. Res., 2017; 45(1):45–51.
4. Hall III C., Schwarz J., Shi J., Mazza G., LeMaguer M., ed. Functional Foods: Biochemical Processing Aspects 2. CRC Press; s. 241.
5. Luo X., Chen B., Yao S., Zeng J. Simultaneous Analysis of Caffeic Acid Derivatives and Alkamides in Roots and Extracts of Echinacea Purpurea by HPLC PDA‑ESI MS. J. Chromatogr. A, 2003; 986:73–81.
6. Pellati F., Benvenuti S., Melegari M., Lasseigne T. Variability in the Composition of Antioxidant Compounds in Echinacea Species by HPLC. Phytochem. Anal., 2005; 16:77–85.
7. Thygesen L., Thulin J., Mortenson A., Skibsted L.H., Molgaard P. Antioxidant Activity of Cichoric Acid and Alkamides from Echinacea Purpurea, Alone and in Combination. Food Chem., 2007; 101:74–81.
8. Luo X., Chen B., Yao S., Zeng J. (viz ref. 5).
9. Jablonski J., Wheat T., Diehl D. Developing Focused Gradients for Isolation and Purification. Waters Application Note 720002955, 2009.
10. DeLano M., et al. Anal. Chem., 2021; 93:5773–5781.
11. Jablonski J. Applying the 5 Rules of Scale Up in LC Purification. Waters Corporation; Article 720008481, 2024.
12. Bridging the Performance Gap from Analytical to Prep. Waters Corporation; Wall Chart 720002117, 2023.
13. Guidance for First Time Purification Success for Your Precious Targets. Waters Corporation; Infographic 720008209, 2024.
14. Van Deemter J., Zuiderweg F., Klinkenberg A. Longitudinal Diffusion and Resistance to Mass Transfer as Causes of Nonideality in Chromatography. Chem. Eng. Sci., 1956; 5:271–289.
15. Neue U. HPLC Columns: Theory, Technology and Practice. Wiley‑VCH, 1997; s. 17–23.