A versatile reversed phase platform for short, intermediate, and long nucleic acid analysis

Význam tématu

Reverzní fázová chromatografie nukleových kyselin je klíčová pro kvalitativní a kvantitativní analýzu oligonukleotidů i dlouhých RNA a DNA fragmentů. Vývoj flexibilních stacionárních fází umožňuje rychlou separaci látek širokého rozsahu délek (10–10 000 nukleotidů) a je zásadní pro charakterizaci terapeutických siRNA, gRNA a mRNA vakcín.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje schopnost nové polymerní, supermakroporézní chromatografické pryskyřice DNAPac RP (4 μm, póry 50–2000 Å) oddělit krátké, střední i dlouhé nukleové kyseliny.
Pro srovnání jsou využity tradiční C18 křemíkové kolony (2,5 μm, 300 Å a 1,7 μm, 300 Å).

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Thermo Scientific Vanquish Horizon
• Kolony: DNAPac RP 4 μm, 2,1×50 mm; C18 2,5 μm a 1,7 μm, 2,1×50 mm
• Mobilní fáze: 0,1 M triethylammonium acetát (TEAA) jako iontově párovací činidlo a acetonitril (ACN)
• Detekce UV při 260 nm
• Chroma Data System Thermo Scientific Chromeleon 7.2.10

Hlavní výsledky a diskuse

DNAPac RP kolona prokázala vysoké rozlišení a ostré píky pro oligonukleotidy 12–40 mer i pro střední (98–100 mer) a dlouhé fragmenty až do 5 000 bp během několika minut.
Proti C18 křemíkovým kolonám nabídla širší rozsah pórů lepší přístupnost a účinnější oddělení i vysoce podobných sekvencí.
Separace dvojšroubovicové DNA (67–1353 bp) byla dokončena za 12 minut, což u tradičních kolon není možné díky omezené velikosti pórů.

Přínosy a praktické využití metody

• Univerzální analýza nukleových kyselin pro farmaceutický průmysl, výzkum i kontrolu jakosti
• Zkrácení doby analýzy a zlepšení citlivosti ve srovnání s konvenčními kolonami
• Možnost aplikace na komplexní mRNA produkty, gRNA pro CRISPR/Cas9 nebo siRNA

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování zahrnuje integraci s hmotnostní spektrometrií pro detailní charakterizaci posttranslačních modifikací a mapování sekvence.
Rozvoj stacionárních fází s ještě širším pórovým rozsahem a vyšší chemickou stabilitou pro aplikace v extrémních podmínkách.

Závěr

DNAPac RP kolona představuje flexibilní a efektivní platformu pro separaci nukleových kyselin širokého rozsahu délek, překonává konvenční C18 křemíkové materiály a otevírá nové možnosti ve výzkumu a výrobě bioterapeutik.

Reference

1. Vanhinsbergh C.J., Criscuolo A., Sutton J.N., Murphy K., Williamson A.J.K., Cook K., Dickman M.J. Characterization and Sequence Mapping of Large RNA and mRNA Therapeutics Using Mass Spectrometry. Analytical Chemistry 2022, 94, 7339–7349.
2. Wei B., Wang J., Cadang L., Goyon A., Chen B., Yang F., Zhang K. Development of an ion pairing reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry method for characterization of clustered regularly interspaced short palindromic repeats guide ribonucleic acid. Journal of Chromatography A 2022, 1665:462839.
3. Packer M., Gyawali D., Yerabolu R., Schariter J., White P. A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems. Nature Communications 2021, 12:6777.