Antibody subunit analysis workflow on a quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: from optimized sample preparation to data analysis

Význam tématu

Analýza protilátek na úrovni podjednotek nabízí detailní pohled na jejich strukturní variabilitu a přesné stanovení molekulové hmotnosti. V biopharmaceutickém výzkumu a výrobě jsou tyto postupy klíčové pro zajištění kvality a konzistence terapeutických monoklonálních protilátek (mAb). Komplementární informace získané ze subunit analýzy doplňují výsledky z intact mass a peptidového mapování.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem Application Note bylo popsat komplexní workflow pro subunit analýzu mAb na platformě Thermo Scientific Q Exactive BioPharma s použitím middle-down přístupu. Klíčové kroky zahrnují:

• optimalizaci přípravy vzorku (enzymatická digest a redukce)
• chromatografické oddělení podjednotek
• MS analýzu pro potvrzení hmotnosti a sekvenční ověření

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: Trastuzumab, infliximab, bevacizumab získané ve formulaci nebo lyofilizované podle protokolů výrobce.

Enzymatická příprava:

• Digest s IdeS (FabRICATOR®) za vzniku F(ab´)2 a scFc fragmentů.
• Následná redukce disulfidických vazeb DTT nebo TCEP (50 mM) s/bez 4 M GdHCl při 25 °C nebo 57 °C.

Chromatografie:

• Vanquish Flex UHPLC se stupňovitou gradientní RP separací na MAbPac RP 2.1×50 mm, teplota 80 °C, flow 250 µL/min.
• Optimální gradienty: 9–10 min pro základní separaci, až 16.5 min pro infliximab (Lys‐varianty scFc).

Hmotnostní spektrometrie:

• Q Exactive HF/HF-X s BioPharma Option (Intact Protein Mode, HMR Mode).
• Intact Protein Mode – nižší tlak v HCD buněčné komoře pro delší životnost proteinových iontů a vyšší nabíjení.
• Rozlišení Full MS: 240 000 (monoisotopické hmotnosti) nebo 15 000 (průměrné hmotnosti); PRM pro middle-down se 120 000.

Software: BioPharma Finder™ 3.0 pro dekonvoluce a přiřazení fragmentů.

Hlavní výsledky a diskuse

1) Redukce disulfidických vazeb:

• Bez denaturace (GdHCl) je redukce neúplná – rozdělení na směs redukovaných, částečně redukovaných a neredukovaných podjednotek.
• Přidání 4 M GdHCl a 50 mM DTT/TCEP při 57 °C vede k jednoznačné plné redukci, detekci dvou eluačních píků (light chain, heavy chain) a hmotnostní přesnosti <5 ppm.

2) Separace subunit po IdeS digestu:

• F(ab´)2 se redukcí štěpí na Fd′ a LC podjednotky (~23–25 kDa), scFc (~23–25 kDa).
• Optimální gradienty zajišťují baseline resoluci všech tří podjednotek u trastuzumabu a bevacizumabu; pro infliximab nejsou separovány dvě Gly-Lys formy scFc bez prodlouženého gradientu.

3) MS a middle-down analýza:

• Wide isolation window (200–300 Th) kolem 950 m/z vyhovuje neznámým vzorkům a rychlému screeningu, užší (5–20 Th) zvyšuje selektivitu.
• Stepped collision energies (NCE 10/13/16) nebo oddělené PRM scany zvyšují pokrytí sekvence: až 33 % pro LC, 32 % pro scFc, 19 % pro Fd′.
• Nezredukované intra-chain disulfidy brání fragmentaci v daných oblastech, z čehož lze usuzovat jejich polohu.

Přínosy a praktické využití metody

• Zajištění úplné redukce podjednotek minimalizuje chyby ve stanovení hmotnosti a maximalizuje sekvenční pokrytí.
• Middle-down workflow umožňuje sekvenční potvrdění mAb podjednotek bez další přípravy.
• Flexibilní nastavení režimů Orbitrap MS (Intact Protein Mode, HMR) pokrývá široké rozmezí hmotností a typů analýz.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj softwarových algoritmů pro automatizovanou dekonvoluci a interpretaci middle-down dat.
• Integrace workflow do kvality výroby (QA/QC), rutinní screening biosimilars a degradace spojené s produktem.
• Rozšíření na kontrolu post-translačních modifikací a glykových vzorů v reálném čase.

Závěr

Popisovaný workflow kombinuje optimální podmínky přípravy vzorku, vysoce výkonnou chromatografii a flexibilní režimy Q Exactive BioPharma MS pro přesné stanovení hmotnosti a detailní middle-down analýzu mAb subunit. Kompletní redukce s 4 M GdHCl a DTT/TCEP při 57 °C je klíčová pro robustní a reprodukovatelné výsledky. Stepped collision energies a správná volba šířky izolace umožňují vysoké sekvenční pokrytí podjednotek.

Reference

1. Scheffler K.; Damoc E. Full characterization of heterogeneous antibody samples under denaturing and native conditions on a Q Exactive BioPharma mass spectrometer. Thermo Fisher Scientific Application Note 72348, 2017.
2. Scheffler K.; Viner R.; Damoc E. High resolution top-down experimental strategies on the Orbitrap platform. J. Proteomics 2018, 175, 42–55.
3. Farrell A.; Carillo S.; Scheffler K.; Cook K.; Bones J. Monoclonal antibody sequence assessment using a hybrid quadrupole-Orbitrap mass spectrometer. Anal. Methods 2018, 10, 3100–3109.
4. Carillo S.; Jakes C.; Zaborowska I.; Bones J. IdeS-cleaved mAb subunit analysis with LC-HRAM-MS: a quick and accurate comparison of biosimilar and originator biotherapeutics. Thermo Fisher Scientific Application Note 21806, 2018.