Evaluation of OptiSpray technology and the Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer for proteomics applications

Shrnutí: Hodnocení technologie OptiSpray a Orbitrap Astral Zoom pro aplikace proteomiky

Význam tématu

Vysokoprůchodová, citlivá a reprodukovatelná LC‑MS proteomika je klíčová pro biologický výzkum, farmaceutický vývoj a rutinní laboratorní workflowy. Tradiční nanoflow chromatografie přináší omezení v podobě citlivosti na polohu emitru, obtížného opětovného sestavení a variability mezi běhy. Technologie OptiSpray a nové konstrukce µPAC kazet cílí na automatizaci, opakovatelné nastavení emitru a robustní provoz, což má potenciál zvýšit průchodnost a stabilitu dat ve vysokoprůchodových režimech.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit výkon OptiSpray Ion Source ve spojení s µPAC Neo HT (5,5 cm) kazetou a Orbitrap Astral Zoom MS pro vysokoprůchodovou bottom‑up proteomiku. Hodnotily se citlivost, počet identifikovaných proteinových skupin a peptidů při různých načteních HeLa digestu (20–200 ng), reprodukovatelnost přes opakované injekce (až 100–200 běhů), stabilita po skladování kazety a efektivita LC‑MS (produktivita). Data byla zpracována v Proteome Discoverer 3.3 SP1 s DIA‑NN Enterprise 2.5.2 (FDR 1%).

Použitá metodika

Klíčové body metodiky:

• Chromatografie: µPAC Neo HT 5,5 cm v konfiguraci Trap‑and‑Elute na Vanquish Neo UHPLC s PepMap Neo trap cartridgem (300 µm × 5 mm, 5 µm).
• Gradienty/produktivita: čtyři režimy pro 300, 180, 100 a 60 SPD (samples per day) s gradienty ~2,5; 5,8; 10,8 a 20,5 min; průtoky 3–0,75 µL/min. Pro 180/100/60 SPD byla na začátku použita vyšší rychlost průtoku s rychlým snížením před elucí peptidů pro rovnoměrnější eluci; 300 SPD běžel konstantně na 3 µL/min.
• Snímek MS: Orbitrap Astral Zoom MS v režimu data‑independent acquisition (DIA) s úzkými izolačními okny; parametry akvizice byly přizpůsobeny pro vysokou průchodnost a citlivost.
• Vzorky: Thermo Scientific Pierce HeLa digest, připraven jako zásobní roztok 100 ng/µL (20 µg rehydratováno a ředěno do více studených vtoků).
• Analýza dat: Proteome Discoverer + DIA‑NN, výchozí nastavení modifikací (oxidace dynamická, karbamidomethylace statická), FDR 1 % pro vysoce důvěryhodné výsledky.

Použitá instrumentace

• OptiSpray Ion Source (Thermo Scientific) se samostatně rozpoznávanou µPAC Neo HT kazetou s integrovaným vyměnitelným emittem (tapered emitter, 15 µm).
• µPAC Neo HT 5,5 cm kolona (trap‑and‑elute konfigurace) a PepMap Neo trap cartridge (5 µm, 300 µm × 5 mm).
• Vanquish Neo UHPLC system (Thermo Scientific).
• Orbitrap Astral Zoom Mass Spectrometer (Thermo Scientific) pro DIA akvizice.
• Software: Proteome Discoverer 3.3 SP1 s DIA‑NN Enterprise 2.5.2 pro zpracování dat (Human UniProt FASTA ~20 607 záznamů).

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní zjištění studie:

• Identifikace: Při zatíženích HeLa 20–200 ng a režimech 300–60 SPD se počet identifikovaných proteinových skupin pohyboval přibližně od 6 232 do 9 363, počet peptidových skupin od ~70 643 do 175 129. Vyšší gradienty (delší časy analýzy) zvyšovaly počet identifikací, přesto i nejrychlejší 2,5min metoda (300 SPD) poskytla vysoký počet proteinových skupin při nízkém zatížení.
• Reprodukovatelnost: Při 100 a 200 opakovaných injekcích (200 ng HeLa) byly chromatogramy a retenční časy vysoce konzistentní s počáteční drobnou kondicionací kolony. Průměrné počty identifikací pro 180 a 100 SPD byly ~8 329 / 8 749 proteinových skupin a ~123 567 / 147 847 peptidů; %CV pro počty identifikací byly velmi nízké (<2 % pro proteiny, ~1,6–1,8 %), což indikuje vynikající běh‑na‑běh stabilitu.
• Robustnost kazety: Automatizovaný postup optimalizace pozice emittru a uložení pozice v paměti kazety umožnil opakované přesné umístění po demontáži a skladování. Po téměř dvoutýdenním skladování při pokojové teplotě byly chromatogramy i identifikace prakticky nezměněny — při 200 ng se změny nepřehouply přes ~1,9 % u proteinů a ~6,7 % u peptidů.
• Produktivita LC‑MS: Díky adaptaci průtoků a rychlému snížení před elucí peptidů dosáhli autoři LC‑MS produktivity nad 86 % pro režimy s pohyblivým průtokem.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy z implementace OptiSpray + µPAC Neo HT + Orbitrap Astral Zoom:

• Vysoká průchodnost s přijatelnou ztrátou citlivosti — vhodné pro screeningové a velké kohortní studie.
• Automatizovaná a opakovatelná poloha emitru snižuje potřebu manuálních zásahů a minimalizuje mezi‑běhovou variabilitu.
• Robustnost kazet a možnost skladování bez významného dopadu na výkon zjednodušují logistiku provozu a snižují prostoj.
• Dosažené nízké %CV naznačují, že metoda je vhodná i pro kvantitativní studie, kde je klíčová opakovatelnost (QA/QC a longitudinální studie).

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje a aplikací:

• Rozšíření do klinických vysokoprůchodových workflowů, za předpokladu validace a souladu s regulačními požadavky.
• Optimalizace DIA metod pro další zvýšení hloubky proteomu při zachování vysoké průchodnosti (např. adaptivní okna, zrychlené HCD nastavení).
• Integrace s automatizovanými přípravami vzorků a LIMS pro plně nepřetržitý provoz v bodech, kde je potřeba analyzovat stovky až tisíce vzorků týdně.
• Další vylepšení kazet a emittrů vedoucí ke zvýšení robustness při velmi nízkých nálozích (sub‑ng až nízké‑pg oblasti).

Závěr

OptiSpray technologie ve spojení s µPAC Neo HT kazetou a Orbitrap Astral Zoom MS poskytuje robustní, vysoce reprodukovatelnou a produktivní platformu pro vysokoprůchodovou bottom‑up proteomiku. Umožňuje dosahovat vysokého počtu identifikací i při nízkých nálozích a zachovává stabilitu výkonu přes opakované injekce i po krátkodobém skladování kazety. Tato kombinace je perspektivní pro aplikace vyžadující rychlé a spolehlivé zpracování velkých souborů vzorků.

Reference

• Arrey T. N., Reinhardt T., Walker K., Silveira J., Boeser C., Zheng R., Valenta A., Op de Beeck J., Wouters E. R., Damoc E., Evaluation of OptiSpray technology and the Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer for proteomics applications, Thermo Fisher Scientific, 2026.