Evaluation of OptiSpray technology and the Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer for proteomics applications

Hodnocení technologie OptiSpray a Orbitrap Astral Zoom pro proteomiku

Význam tématu:

Vysokopropustná a opakovatelná LC‑MS proteomika je klíčová pro aplikace v průmyslovém výzkumu, farmaceutickém vývoji a velkoplošných biologických studiích. Zlepšení robustnosti nanoflow přenosu iontů, přesného umístění emitéru a zkrácení gradientů zvyšuje produktivitu laboratoře, snižuje variabilitu mezi běhy a umožňuje spolehlivé analýzy velkého počtu vzorků. Studie hodnotí OptiSpray technologii s µPAC Neo HT cartridgem na Orbitrap Astral Zoom MS pro dosažení těchto cílů.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo posoudit výkonnost, robustnost a reprodukovatelnost kombinace OptiSpray ion source a µPAC Neo HT (5.5 cm) cartridgu v režimu vysoké propustnosti (až 300 vzorků/den) při bottom‑up proteomickém profilování. Hodnocení zahrnovalo: optimalizaci pozice emitéru, měření identifikací proteinů a peptidů při různých dávkách HeLa digestu (20–200 ng) a různých režimech průtoku (300, 180, 100, 60 SPD), opakovatelnost přes 100–200 injekcí a stabilitu po dvoutýdenním skladování cartridge při pokojové teplotě.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Chromatografie: Vanquish Neo UHPLC v trap‑and‑elute konfiguraci se µPAC Neo HT cartridgem (5.5 cm) a PepMap Neo 5 µm C18 300 µm×5 mm jako trap kolonkou.
• Gradienty a throughput: čtyři režimy – 300 SPD (2.5 min), 180 SPD (5.8 min), 100 SPD (10.8 min) a 60 SPD (20.5 min). Pracovní průtoky se pohybovaly mezi 3 a 0.75 µL/min; 300SPD používal konstantních 3 µL/min, u ostatních byly použity vyšší počáteční průtoky následované rychlým snížením těsně před elucí peptidů pro rovnoměrnější rozdělení eluce a vysokou LC‑MS produktivitu (>86 %).
• Příprava vzorku: Thermo Scientific Pierce HeLa digest rekonstituovaný v 0.015 % DDM / 0.1 % TFA do koncentrace 100 ng/µL, sonikace a rozdělení do 96‑well desky; injekce odpovídajících objemů pro dosažení 20–200 ng na injekci.
• MS akvizice: Orbitrap Astral Zoom MS v režimu Data‑Independent Acquisition (DIA) s úzkými izolačními okny optimalizovanými pro jednotlivé metody; DIA parametry zahrnovaly rozsahy prekurzorů ~380–980 m/z a variabilní šířky izolačních oken (např. 5–2 Th dle metody). Byly použity krátké maximální doby injekce pro MS/MS (řádově jednotky až desítky ms) pro dosažení vysokého počtu skenů během krátkých gradientů.
• Vyhodnocení dat: Proteome Discoverer Software 3.3 SP1 ve spojení s DIA‑NN Enterprise 2.5.2; vyhledávání proti Human UniProt FASTA (~20 607 záznamů), nastavení: oxidace (dynamická), karbamidomethylace (statická); výsledky filtrovány na 1 % FDR a zpracovávány trojicemi raw souborů pro každou kombinaci dávka/throughput, reprodukovatelnostní experimenty zpracovány jednotlivě.

Instrumentace (samostatná sekce):

• Ion source: Thermo Scientific OptiSpray Ion Source s µPAC Neo HT cartridge (integrovaný vyměnitelný kuželový emitér 15 µm). Emitorová pozice byla automaticky optimalizována a uložena do paměti cartridgu, což umožnilo přesné obnovení polohy po opětovném nasazení.
• Kapilára: připojení LC k source 55 cm × 20 µm transfer linií.
• MS: Thermo Scientific Orbitrap Astral Zoom MS – vysokorychlostní analyzátor optimalizovaný pro DIA akvizice.
• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Neo.
• Software: Proteome Discoverer 3.3 SP1 a DIA‑NN Enterprise 2.5.2 pro zpracování DIA dat.

Hlavní výsledky a diskuse

Výkonnost a identifikace:

• Při dávkách 20–200 ng HeLa a režimech 300–60 SPD bylo dosaženo 6 232 až 9 363 identifikovaných proteinových skupin a 70 643 až 175 129 unikátních peptidových skupin v závislosti na délce gradientu a množství vzorku. Delší gradienty a vyšší množství vzorku vedly k vyššímu počtu identifikací (nejvyšší výsledky při 200 ng a 20.5 min gradientu).
• Příklad: při velmi rychlém 2.5 min gradientu (300 SPD) bylo z 20 ng dosaženo ~7 849 proteinových skupin a ~103 325 peptidových skupin; při nejdelším gradientu (60 SPD) bylo z 200 ng dosaženo až ~9 363 proteinů a ~175 129 peptidů.

Reprodukovatelnost a robustnost:

• Opakovatelnost přes 100 injekcí (200 ng HeLa) byla vysoká: průměrné počty identifikací se pohybovaly okolo 8 329 (180 SPD) a 8 749 (100 SPD) proteinových skupin a 123 567 a 147 847 peptidů, přičemž variační koeficienty (%CV) pro počty identifikací byly velmi nízké (<2 % pro proteiny a podobně nízké hodnoty pro peptidy).
• Po znovupřipojení cartridgu, který byl skladován ~2 týdny při pokojové teplotě, se automaticky obnovila optimální pozice emitéru z paměti cartridgu; po kondicionaci byly base peak chromatogramy téměř identické a změny v počtu identifikací byly malé (proteinové ID <1.9 %, peptidové ID <6.7 %).
• Stabilita během 200 injekcí vykazovala CV 1.6 % pro proteinové identifikace a 1.8 % pro peptidové identifikace, což dokládá vysokou run‑to‑run reprodukovatelnost.

Chromatografie a produktivita:

• Strategie s vyšším počátečním průtokem následovaným rychlým snížením před elucí peptidů vedla k rovnoměrnějšímu rozložení eluce a LC‑MS produktivitě nad 86 %.
• Base‑peak chromatogramy z experimentů opakovaných po dvou týdnech byly vysoce konzistentní, což potvrzuje mechanickou a chromatografickou stabilitu systému.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy:

• Vysoká propustnost: možnost zpracování až 300 vzorků/den při přijatelném kompromisu mezi hloubkou proteomu a rychlostí.
• Robustnost: automatické uložení a obnovení pozice emitéru minimalizuje manipulační chyby při výměně cartridge a zvyšuje dostupnost systému bez ztráty výkonu.
• Reprodukovatelnost: nízké %CV v počtech identifikací umožňuje spolehlivé srovnávání velkých souborů dat bez nutnosti rozsáhlého vyrovnávání mezi běhy.
• Flexibilita: uživatelé mohou volit mezi maximální rychlostí (300 SPD) a maximální hloubkou analýzy (60 SPD) podle požadavků studie.

Použitelné oblasti:

• Velkoplošné laboratorní studie, farmakoproteomika, screeningové kampaně a QC protokoly vyžadující vysoký průchod vzorků s konzistentní citlivostí.
• Platforma vhodná pro nasazení v rutinních analytických laboratořích, které požadují jednoduchou údržbu emitéru a stabilní výsledky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Další zrychlování workflow: zdokonalování gradientních strategií a read‑out rychlosti MS by mohlo umožnit ještě vyšší throughput bez výrazné ztráty hloubky proteomu.
• Automatizace a integrované QC: rozšíření automatizované optimalizace emitéru a vzdáleného monitoringu stavu cartridge pro větší robustnost v multi‑uživatelských prostředích.
• Pokročilé zpracování dat: větší využití algoritmů pro DIA (včetně strojového učení) pro zlepšení identifikací v krátkých gradientech a nízkých dávkách vzorku.
• Rozšíření aplikací: přizpůsobení platformy pro citlivé analýzy, např. v single‑cell proteomice nebo pro klinické pre‑klinické studie vyžadující vysokou propustnost.

Závěr

Kombinace OptiSpray ion source s µPAC Neo HT cartridge a Orbitrap Astral Zoom MS představuje robustní, vysoce propustné řešení pro bottom‑up proteomiku. Systém dosahuje stovek až tisíců proteinových identifikací i při velmi krátkých gradientech, přičemž si udržuje vynikající reprodukovatelnost a odolnost při opakovaných injekcích a po dočasném skladování cartridge. Tato konfigurace je vhodná pro laboratorní provoz, kde jsou klíčové vysoká produktivita a stabilita měření.

Reference

Arrey T. N., Reinhardt T., Walker K., Silveira J., Boeser C., Zheng R., Valenta A., Op de Beeck J., Wouters E. R., Damoc E. Evaluation of OptiSpray technology and the Orbitrap Astral Zoom mass spectrometer for proteomics applications. Thermo Fisher Scientific (Application note / whitepaper). 2026.