Identification and Quantitation of NNitrosamines in Normal Saline Intravenous Infusion bags Using UHPLC-MS/MS

Význam tématu

Detekce a kvantifikace N‑nitrosaminů v parenterálních přípravcích je kritická z hlediska bezpečnosti pacientů a souladu s regulacemi. N‑nitrosaminy, včetně látek jako NDMA, NDEA nebo NDBA, jsou karcinogenní a jejich přítomnost v léčivých přípravcích nebo obalových materiálech vyvolala rozsáhlá vyšetřování a aktualizaci regulačních požadavků. U intravenózních (IV) infuzních vaků hraje roli možná kontaminace z materiálů obalu nebo priméru tisku, přičemž i krátkodobé nebo opakované podávání může vyžadovat citlivé analytické metody pro zajištění bezpečnosti.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a demonstrovat citlivou chromatograficko‑hmotnostní metodiku pro identifikaci a kvantifikaci sedmi malých dialkyl nitrosaminů (NDMA, NMBA, NDEA, NEIPA, NDPA, NDIPA, NDBA) v 0,9% roztoku NaCl z IV infuzních vaků. Metodika kombinuje UHPLC separaci s pozitivní APCI ionizací a tandemovou kvadrupólovou MS (Xevo TQ Absolute XR) a datové workflow zajišťuje waters_connect software. Hlavním cílem bylo dosáhnout nízkých ng/mL a pg/mL úrovní kvantifikace s vysokou liniaritou a opakovatelností.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda: UHPLC separace na ACQUITY Premier HSS T3 koloně (1.8 µm, 2.1 x 100 mm) s použitím delay column (Atlantis Premier BEH C18 AX, 2.1 x 50 mm) za účelem potlačení přetrvávajících systémových interferencí (zejména u NDBA). První 1.75 min chromatografického běhu byl odváděn do odpadu, aby se minimalizoval přenos solného matrixu do MS.

Mobilní fáze: 5 mM ammonium formát + 0.1% kyselina mravenčí (A: voda, B: methanol). Průtok 0.30 mL/min, injekční objem 20 µL, teplota kolony 45 °C, vzorkovací teplota 6 °C.

MS: Xevo TQ Absolute XR, APCI pozitivní režim. Klíčové zdrojové parametry: source temp 120 °C, probe temp 250 °C, desolvation gas 800 L/hr, cone gas 300 L/hr, korona proud 2 µA. Metoda používá MRM přechody optimalizované infusion tuningem a v některých případech "soft transmission" pro snížení in‑source fragmentace.

Informatika: waters_connect for Quantitation pro optimalizaci MRM, generování kvantifikační metody, zpracování, kontrolu kvality (rule sety) a reportování v souladu s 21 CFR Part 11 (elektronické podpisy, audit trail). Kalibrace: vážená regrese 1/x, rozsah typicky 0.01–100 ng/mL (některé analyty od 0.02 ng/mL), bez použití interních standardů.

Hlavní výsledky a diskuse

- Citlivost a linearita: Metoda dosáhla nízkých pg/mL kvantifikačních limitů a alespoň čtyř řádů lineárního dynamického rozsahu; R2 hodnoty vyšší než 0.99 při použití 1/x vážení.

- Precision & accuracy: QC vzorky v matrixu (0.075, 0.75, 7.5, 75 ng/mL; n=6) vykázaly průměrné přesnosti 88–110 % a CV v rozmezí 0.033–5.5 %.

- Matrix efekty: Porovnání odezev ve 0.9% NaCl vůči solventu ukázalo %response 88–105 % s %CV 0.9–10.5; potlačení či zesílení signálu se pohybovalo v rozmezí −9.3 až +13.2 % (SD 0.9–11.3 %), tedy minimální matriční vliv.

- Interference a delay column: U NDBA byla pozorována přetrvávající interference od systémového pozadí; použití delay column významně zlepšilo selektivitu a umožnilo dosáhnout nižších detekčních limitů. Odstavení prvních 1.75 min do odpadu též omezilo dopad soli na zdroj MS.

- Identifikace v reálných vzorcích: V sadě komerčně získaných 100 mL IV vaků (Sample Set 1) byly detekovány složky odpovídající NDEA a NDMA (tR 4.05 a 2.35 min). Identifikace byla podpořena MRM ion‑ratio flaggingem, cílenými MS/MS experimenty (fragmentace m/z 103 pro NDEA) a nezávislým potvrd­ením elementárního složení na QTOF (Xevo G3). Batch získaný od autorizovaného dodavatele (Sample Set 2, 500 mL, n=6) nevykázal přítomnost sedmi sledovaných nitrosaminů.

- Kvantifikace a spike recovery: Spikované recovery pro NDMA a NDEA v pozitivních infuzních roztocích byly 89.4–98.4 % s CV 3.3–6.0 %.

Přínosy a praktické využití metody

- Metoda umožňuje spolehlivou detekci a kvantifikaci nitrosaminů na úrovních relevantních pro farmaceutický dohled a vyšetřování kontaminace obalových materiálů.
- Použití MRM s ion‑ratio flaggingem a cíleným MS/MS zvyšuje jistotu identifikace v přítomnosti blízkých nebo isobarických interferencí.
- Delay column a solvent divert praktiky výrazně snižují vliv systémového pozadí a soli z matrixu, což je klíčové pro vodné infuzní matrice.
- waters_connect zjednodušuje zpracování dat, zajišťuje traceabilitu a umožňuje rychlé vyhodnocení pomocí konfigurovatelných pravidel (acceptance criteria), což je výhodné pro rutinní laboratorní workflow.

Budoucí trendy a možnosti využití

- Rozšíření panelu analyzovaných nitrosaminů včetně NDSRIs a sloučenin vyšší molekulární hmotnosti pro komplexnější screening obalů a hotových produktů.
- Integrace interních standardů (stabilně označených izotopů) pro zlepšení kvantifikace a korekci variací v ionizaci a přenosu.
- Další evaluace a validace metodologií napříč různými typy infuzních vaků, balicích materiálů a výrobními šaržemi za účelem lepšího porozumění zdrojům kontaminace.
- Využití HRMS (QTOF/Orbitrap) pro nestrukturální screening neznámých nitrosaminů a jejich elementární složení, následované kvantifikací na triple quadrupólu.
- Rozvoj standardizovaných postupů a harmonizovaných akceptačních limitů pro leachables v kontejnmentech IV přípravků, včetně aplikací „less‑than‑lifetime“ úprav AI hodnot.

Závěr

Studie prezentuje robustní UHPLC‑MS/MS přístup pro detekci a kvantifikaci sedmi malých dialkyl nitrosaminů v 0.9% NaCl z IV vaků s dosahem nízkých pg/mL citlivosti, vysokou liniaritou a uspokojivou přesností a přesností. Klíčové kroky zahrnují použití delay column a divert ventilu ke snížení systémových interferencí a pracovní postupy založené na MRM ion‑ratio a cílené MS/MS pro zvýšení jistoty identifikace. Metoda je vhodná pro screening a vyšetřování možnosti leachables, avšak laboratoře musí provést vlastní validaci dle svých regulačních a kvalitativních požadavků.

Reference

1. Moser J., Schlingemann J., Saal C. N‑Nitrosamines Impurities in Pharmaceuticals - The Abrupt Challenges that Resulted, the Evolving Science, and the Regulatory Framework. Journal of Pharmaceutical Sciences 2023, 112(5):1161–1162.
2. Teasdale A., Moser J., Ford J.G., Creasy J. N‑Nitrosamines. In: Mutagenic Impurities. Wiley, 2021, pp.269–320.
3. Bharate S.S. Critical Analysis of Drug Product Recalls due to Nitrosamine Impurities. Journal of Medicinal Chemistry 2021, 64(6):2923–2936.
4. Schlingemann J., et al. The Landscape of Potential Small and Drug Substance Related Nitrosamines in Pharmaceuticals. Journal of Pharmaceutical Sciences 2023, 112(5):1287–1304.
5. Holzgrabe U. Nitrosated Active Pharmaceutical Ingredients - Lessons Learned? Journal of Pharmaceutical Sciences 2023, 112(5):1210–1215.
6. ICH M7(R2) Guideline on assessment and control of DNA reactive (mutagenic) impurities in pharmaceuticals.
7. FDA. Control of Nitrosamine Impurities in Human Drugs. FDA guidance document.
8. EMA. Scientific review on the risk of nitrosamine impurities in human medicines. European Medicines Agency review.
9. FDA CDER. Emerging Scientific and Technical Information on Leachable NDBA and Other Small‑Molecule Nitrosamines in Infusion Bags. August 18, 2025.
10. Golob N., et al. Nitrocellulose blister material as a source of N‑nitrosamine contamination of pharmaceutical drug products. International Journal of Pharmaceutics 2022, 618:121687.
11. Felter S.P., et al. Evaluating the lifetime cumulative dose as a basis for carcinogenic potency of nitrosamines. Regulatory Toxicology and Pharmacology 2025, 162:105903.
12. Wills J.W., et al. Mutagenic and carcinogenic potency determinations for NDMA support the cumulative dose assumption underpinning the less‑than‑lifetime Threshold of Toxicological Concern. Archives of Toxicology 2026.
13. Twohig M. The Use of a Delay Column to Mitigate Persistent Contaminant Peaks in the Trace Level Quantitation of NDBA in Normal Saline IV Infusion Bags using UHPLC‑MS/MS. Waters Application Note 720009311, May 2026.