MAP SEQUENCE - A NOVEL SOFTWARE APP FOR RAPID AND AUTOMATED SEQUENCE MAPPING OF mRNA MOLECULES

Význam tématu

Mapování sekvence mRNA je klíčové pro ověření identity, integrity a chemických modifikací terapeutických mRNA produktů. Spolehlivá, rychlá a automatizovaná analýza digesta mRNA umožňuje podporu vývoje, kontroly kvality a regulovaných výrobních procesů u syntetických oligonukleotidů, sgRNA a mRNA vakcín či léčiv.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované práce je demonstrovat schopnosti nové softwarové aplikace MAP Sequence (verze 2.0) a doprovodné SYNTHETIC Library App pro plně automatizované mapování sekvence mRNA na základě LC–MS MSE (data-independent acquisition). Studie využívá modelový Fluc (firefly luciferase) mRNA konstrukt (~1 919 nt, Cap1, poly(A) ocas) a panel navržených endonukleáz (RapiZyme MC1, RapiZyme Cusativin a RNase T1) k dosažení vysokého krytí sekvence.

Použitá metodika

• Vzorek: in vitro transkribovaná Fluc mRNA s Cap1 a poly(A) řetězcem (1 919 nt).
• Enzymatické štěpení: paralelní digesce pomocí RNase T1 (standard), RapiZyme MC1 (RNase T2, 5´-uridinová specificita) a RapiZyme Cusativin (RNase T2, 3´-cytidinová specificita). Podmínky enzymů byly optimalizovány kontrolou množství a doby inkubace pro generování překrývajících se produktů a záměrných „missed cleavages“.
• LC: ACQUITY Premier UPLC BSM s 2.1 × 150 mm ACQUITY Premier OST kolonkou. Ion-pair RP mobilní fáze s 10 mM dipropylaminu (DPA/DPD) a 40 mM HFIP; gradient 0→50 % B během 60 min; průtok 0,4 mL/min; teplota 60 °C; injekce 5 µL; UV při 260 nm.
• MS akvizice: Xevo MRT QTof (multi-reflectron TOF) v MSE režimu (DIA). Scany 0,5 s v rozsahu 400–4000 Da; nízkoenergetická MSE s CE 6 V; vysoká energie s rampou 30–55 V.
• Informatika: waters_connect platforma 4.1.0.17, SYNTHETIC Library App 2.0.0 a MAP Sequence App 2.0.0 pro in-silico digesci, přiřazení prekurzorů a fragmentů a automatické rozlišení strukturálních izomerů podle kritérií pokrytí fragmenty.

Použitá instrumentace

• Xevo MRT QTof Mass Spectrometer (Waters) se systémem ACQUITY Premier UPLC.
• ACQUITY Premier OST kolonka 2.1 × 150 mm (P/N 186010541).
• Software a aplikace: waters_connect Informatics Platform 4.1.0.17, SYNTHETIC Library App 2.0.0, MAP Sequence App 2.0.0.

Hlavní výsledky a diskuse

• Vysoké rozlišení a přesnost: Xevo MRT poskytl rozlišení >100 000 FWHM a sub-ppm hmotnostní přesnost (typicky –1 až +1 ppm), což umožnilo přesné přiřazení prekurzorů i fragmentů u oligonukleotidových produktů.
• Krytí sekvence: Kombinace digescí pomocí RapiZyme MC1 a Cusativin dosáhla téměř kompletního krytí Fluc mRNA (95,4 %). Použití více enzymů vedlo k významnému nárůstu celkového pokrytí ve srovnání s RNase T1 samostatně díky generování delších a unikátních fragmentů a překrývajících se produktů.
• Specifická klíčová pozorování: RapiZyme MC1 (5′-uridinová specificita) a Cusativin (3′-cytidinová specificita) mají odlišné hlavní a vedlejší místa štěpení, což umožňuje komplementární mapování. Regulací množství enzymu a doby inkubace lze záměrně vyvolat missed cleavages pro prodloužení unikátních peptidů/oligonukleotidů.
• Informatika a automatizace: MAP Sequence App automaticky přiřazovala digestační produkty na základě nízkoenergetických (prekurzory) a vysokých energetických (fragmenty) MSE kanálů. Aplikace rovněž umožnila automatické rozlišení izomerů pomocí uživatelem definovaných kritérií pokrytí fragmenty (příklad: jeden izomer potvrzen 100% fragmentním pokrytím, druhý byl zamítnut při 50% pokrytí).
• Datová ilustrační zjištění: chromatogramy TIC ukázaly, že většina ESI signálu odpovídala přiřazeným produktům; detailní příklady zahrnovaly překryté XIC pro více nábojových stavů (-2 až -10), dobře rozlišené izotopické distribuce a dot-map fragmentaci pro vyšší oligonukleotidové produkty (např. 18-mer).

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizovaná a validovatelná workflow pro sekvenační ověření mRNA vhodné pro výzkum, vývoj a kontrolu kvality v průmyslu biotechnologií.
• Redukce nutnosti manuální intervence při interpretaci MS2 dat díky kombinaci vysokého rozlišení MS a MSE fragmentace doplněné sofistikovanou informatikou.
• Schopnost rozlišit strukturální izomery a přiřadit delší jedinečné digestační produkty zlepšuje důvěryhodnost identifikačních závěrů a podporuje aplikace jako lot-to-lot kontrola, stabilita a potvrzení modifikací.
• Platforma kompatibilní s compliance-ready prostředím, což umožňuje její nasazení v regulačních a výrobních procesech.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření enzymatického panelu a optimalizace digesčních protokolů pro úplné krytí i u komplikovanějších sekvencí a modifikovaných nukleotidů.
• Integrace pokročilých algoritmů strojového učení pro rychlejší a robustnější interpretaci dat, včetně predikce modifikací a artefaktů během analýzy.
• Zvýšení propustnosti a zkrácení doby analýzy kombinací rychlejších chromatografických metod a vyšší paralelizace datové analýzy.
• Využití v regulovaných prostředích pro rutinní QC, uvolňování šarží a komparativní studie biosimilárních mRNA produktů.
• Další vývoj v oblasti hardwaru (vyšší rozlišení, vyšší citlivost) a nových režimů akvizice pro lepší charakterizaci vzácných modifikací a větších fragmentů.

Závěr

Kombinace cílené enzymatické digesce (RapiZyme MC1 a Cusativin), vysokorozlišovacího MSE akvizičního režimu na Xevo MRT a automatizované interpretace dat pomocí MAP Sequence a SYNTHETIC Library Apps umožnila získat téměř kompletní mapu sekvence Fluc mRNA (95,4 %). Workflow výrazně snižuje potřebu manuálního vyhodnocení, efektivně řeší izomerní ambiguitu a nabízí praktickou cestu pro aplikace v R&D i v regulačně orientované QC praxi.

Reference

1. Tunable Digestion of RNA Using RapiZyme RNases to Confirm Sequence and Map Modifications, 2024, Waters application note P/N 720008539EN.
2. RNA Digestion Product Mapping Using an Integrated UPLC-MS and Informatics Workflow, 2024, Waters application note P/N 720008553EN.
3. Grunberg S, Wolf EJ, Jin J, Ganatra MD, Becker K, Ruse C, Taron CH, Correa IR, Yigit E. Enhanced Expression and Purification of Nucleotide-specific Ribonucleases MC1 and Cusativin. Protein Expr Purif. 2022;190:105987. doi:10.1016/j.pep.2021.105987
4. Thakur P, Atway J, Limbach PA, Addepalli B. RNA Cleavage Properties of Nucleobase-Specific RNase MC1 and Cusativin Are Determined by the Dinucleotide-Binding Interactions in the Enzyme-Active Site. Int J Mol Sci. 2022;23:7021.
5. Sequence Mapping of mRNA Digests Using the Xevo MRT Mass Spectrometer and waters_connect MAP Sequence 2.0 Application, 2025, Waters application note P/N 720009171EN.