sgRNA AND mRNA SEQUENCE MAPPING VIA ENDONUCLEASE DIGESTION AND LC-MS ANALYSIS, USING NOVEL INFORMATICS WORKFLOWS

Význam tématu

Analýza a potvrzení sekvence dlouhých RNA molekul, jako jsou single guide RNA (sgRNA) a messenger RNA (mRNA), jsou klíčové pro vývoj a kontrolu kvality terapeutických RNA produktů a vakcín. Přesné mapování sekvence a modifikací umožňuje ověřit integritu výrobku, identifikovat nežádoucí varianty a podpořit výrobní a regulační procesy. Kombinace cílených endonukleázových digescí s vysoce-výkonnou LC-MS technologií a specializovaným softwarovým zpracováním zrychluje a zvyšuje spolehlivost těchto analýz.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem předložené práce bylo demonstrovat end‑to‑end workflow pro mapování sekvencí sgRNA a mRNA využívající nové rekombinantní endonukleázy (RapiZyme MC1 a RapiZyme Cusativin), vysokorozlišovací QTOF (Xevo MRT) a specializované informatiké nástroje (SYNTHETIC Library a MAP Sequence v rámci waters_connect). Studie ukazuje, jak kombinace více enzymů a datově‑nezávislého fragmentačního režimu (MSE) umožňuje dosáhnout téměř úplného pokrytí sekvence a vysoké jistoty při přiřazení produktů digesce.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: 100‑mer sgRNA standard s 2'‑OMe modifikacemi a fosforotioátovými vazbami na krajích; FLuc mRNA (~1813 nt + Cap1 a poly(A) ocas) připravená in vitro.
• Endonukleázy: RNase T1 (G‑specifická), RapiZyme MC1 (primární štěpení 5' od uridinu: [A/U/C]U; sekundární Cp[A/G]) a RapiZyme Cusativin (3' cytidinová specificita: Cp[A/U/G], UpA; sekundární [A/G]pU, UpU).
• Digesce: příprava pracovních roztoků enzymů (100 U/µL), chromatograficky purifikované a analýza bezprostředně po digesci; použití více enzymů pro překryvné produkty.
• LC podmínky: ACQUITY Premier System, kolona ACQUITY Premier OST 1.7 µm, 300 Å, 2.1 x 150 mm; mobilní fáze obsahující DIPEA/HFIP (pH ~8.5), gradient 0–50 % B za 60 min, 70 °C, tok 0.4 mL/min.
• MS podmínky: Xevo MRT QTOF (multi‑reflectron TOF) s typickým rozlišením ~100 000; DIA MSE akvizice 0.5 s skeny v rozsahu 340–4000 m/z; nízká energie CE 6 V, vysoká energie rampa 45–55 V.
• Informatika: waters_connect platforma s aplikacemi SYNTHETIC Library App 2.0.0 a MAP Sequence App 2.0.0 pro plánování digescí, zpracování dat, přiřazování produktů a automatické generování reportů.

Použitá instrumentace

• UHPLC: ACQUITY Premier System (Binary) s TUV detekcí
• Kolona: ACQUITY Premier OST 1.7 µm, 300 Å, 2.1 x 150 mm
• MS: Xevo MRT QTOF Mass Spectrometer (multi‑reflectron TOF)
• Software: waters_connect, SYNTHETIC Library App, MAP Sequence App

Hlavní výsledky a diskuse

• Pomocí kombinace RapiZyme MC1, RapiZyme Cusativin a RNase T1 bylo dosaženo 100% pokrytí sekvence 100‑mer sgRNA; u FLuc mRNA (~2000 nt) bylo dosaženo 98% pokrytí sekvence při kombinovaném použití tří enzymů.
• SIGNÁLNÍ PŘIŘAZENÍ: 77 teoretických produktů digesce u sgRNA bylo přiřazeno experimentálním datům v rámci stanovených tolerancí (±5 ppm pro prekurzory a fragmenty, ≥70 % izotopová podobnost, minimálně 50 % pokrytí pro jednotlivý produkt).
• Kvalita fragmentace MSE umožnila rozlišení isobarických a izomerických produktů prostřednictvím MS2 dat, což zvýšilo jistotu přiřazení a potvrdilo pořadí nukleotidů v digestech.
• Massová přesnost byla velmi dobrá (průměrná chyba <1 ppm pro přiřazené MC1 produkty) a vysoké rozlišení Xevo MRT umožnilo plné rozlišení izotopických obálek u nabitých stavů (ukázán příklad [M–8H]8•).
• Softwarové nástroje poskytly možnosti plánování digescí (výběr enzymů pro maximalizaci pokrytí), kombinování výsledků z více digescí a automatizované generování zpráv, včetně vizualizace pokrytí sekvence a fragmentačních map.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda nabízí robustní přístup k mapování a ověření sekvencí dlouhých RNA, včetně identifikace modifikací a ověření integrity molekul.
• Víceenzymová strategie zvyšuje pravděpodobnost jedinečných dlouhých digesčních produktů, které jsou snadněji jednoznačně identifikovatelné hmotnostní analýzou.
• Workflow je vhodný pro aplikace v R&D, analytické kontrole kvality a potenciálně pro výrobní kontrolu díky kompatibilitě s compliance‑ready informatikou.
• Automatizované zpracování dat a reportování zkracuje dobu interpretace výsledků a snižuje riziko lidské chyby při mapování rozsáhlých RNA sekvencí.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj enzymů s odlišnou specifitou a kontrolovanými miss‑cleavages může ještě více zlepšit pokrytí a rozlišení komplexních sekvencí a modifikací.
• Integrace vyšší úrovně automatizace a umělé inteligence v softwarových nástrojích může zrychlit interpretaci dat a navrhování optimálních digescí pro specifické cíle.
• Využití ještě vyššího rozlišení a citlivosti MS přístrojů povede k lepšímu rozpoznání nízkoabundantních variant a post‑transkripčních modifikací.
• Standardizace workflow a validace pro regulační použití by umožnila širší nasazení v průmyslové výrobě RNA‑terapeutik a vakcín.

Závěr

Předložené end‑to‑end řešení kombinuje nové cílené endonukleázy, robustní chromatografii, vysokorozlišovací MSE akvizici a specializovanou informatikou. Tento přístup umožnil kompletní mapování 100‑mer sgRNA a téměř úplné (98 %) potvrzení sekvence FLuc mRNA. Workflow nabízí vysokou přesnost, spolehlivost při přiřazení digesčních produktů a praktickou použitelnost v prostředích, kde je vyžadována kontrola kvality a dokumentace analytických výsledků.

Reference

1. Tunable Digestion of RNA Using RapiZyme RNases to Confirm Sequence and Map Modifications, 2024, Waters application note P/N 720008539EN.
2. RNA Digestion Product Mapping Using an Integrated UPLC-MS and Informatics Workflow, 2024, Waters application note P/N 720008553EN.
3. Grunberg S, Wolf EJ, Jin J, Ganatra MD, Becker K, Ruse C, Taron CH, Correa IR, Yigit E. Enhanced Expression and Purification of Nucleotide-specific Ribonucleases MC1 and Cusativin. Protein Expr Purif Acid Res. 2022;190:105987. doi:10.1016/j.pep.2021.105987.
4. Thakur P, Atway J, Limbach PA, Addepalli B. RNA Cleavage Properties of Nucleobase-Specific RNase MC1 and Cusativin Are Determined by the Dinucleotide-Binding Interactions in the Enzyme-Active Site. Int J Mol Sci. 2022;23:7021.
5. Synthetic mRNA Oligo-Mapping Using Ion-Pairing Liquid Chromatography and Mass Spectrometry, 2022, Waters application note P/N 720007669.