Quantification of Biopharmaceuticals in Plasma Using a Multiple Charge Stage Calibration Line

Význam tématu

Elektronové ionizace (ESI) při LC-MS/MS je standardní technika pro kvantifikaci bioterapeutik v biologických matricích. Proteiny, peptidy a oligonukleotidy generují v ESI více nábojových stavů, což rozděluje analytický signál do několika MRM přechodů a snižuje citlivost a přesnost měření. Variabilita rozložení nábojových stavů v závislosti na koncentraci, složení mobilní fáze nebo pH zvyšuje riziko systematických odchylek v kvantifikaci. Řešení spočívá v kombinaci signálů z více precursor→product MRM kanálů do jediné konsolidované kalibrační křivky, což může zlepšit citlivost, rozšířit dynamický rozsah a stabilizovat kvantifikaci v bioanalytických studiích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem dokumentu je předvést praktické použití funkce SUM MRM v softwaru waters_connect MSQuan pro sloučení signálů z více nábojových stavů do jediné kalibrační křivky. Jako případová studie je uvedena kvantifikace antisense oligonukleotidu nusinersen v extraktech z potkaní (rat) plazmy. Autoři demonstrují metodu přípravy vzorku, analytické nastavení LC-MS/MS a dopad součtu MRM signálů na linearitu, citlivost a robustnost analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika (shrnutí):

• Matice: kontrolní potkaní plazma (Wistar Hannover).
• Kalibrace: 0.1–1000 ng/mL; QC úrovně 0.375–750 ng/mL.
• Příprava vzorku: 100 µL plazmy denaturováno, redukováno a digesováno, následně izolace pomocí SPE (OligoWorks SPE Microplate, 2 mg). Extrakty ředěny 1:1 vodou a 20 µL injikováno.
• Chromatografie: ion-pair reverzní fáze na ACQUITY Premier Oligonucleotide C18 2.1 × 50 mm, 1.7 µm, kolona vyhřívána na 60 °C. Gradient 5–45 % organické fáze během 3.25 min při průtoku 600 µL/min. Mobilní fáze A = 1 % HFIP + 0.1 % DIPEA ve vodě; B = 0.75 % HFIP + 0.0375 % DIPEA v 65:35 ACN:H2O.
• Detekce: negativní ESI tandemový kvadrupól v MRM režimu. Cílené nábojové stavy nusinersen: M-7H-7, M-8H-8, M-9H-9.
• MS provozní parametry: kapilární napětí 2.5 kV; desolvace 600 °C; teplota zdroje 150 °C; průtok desolvačního plynu 1000 L/hr; cone gas 150 L/hr.

Použitá instrumentace (výčet):

• Xevo TQ Absolute XR Triple Quadrupole Mass Spectrometer (Waters).
• ACQUITY Premier Oligonucleotide Chromatography Column, 2.1 × 50 mm, C18, 1.7 µm.
• OligoWorks SPE Microplate (2 mg) pro extrakci oligonukleotidů.
• waters_connect MSQuan Software (verze 2.7.0 pro sběr dat; 2.4.0 pro zpracování) se SUM MRMs funkcí.
• UNIFI integrovaný Mass Calculator (použit pro určení cílových m/z).

Hlavní výsledky a diskuse

• Nusinersen elutoval při retention time ~1.9 min. Pro každý z vybraných nábojových stavů (M-7, M-8, M-9) byla získána lineární odpověď v rozsahu 0.1–1000 ng/mL s 1/x vážením. Koeficienty determinace: R2 = 0.9977 (M-7), 0.9992 (M-8), 0.9988 (M-9).
• Individuální MRM kanály tedy vykazovaly vysokou linearitu, avšak signál byl rozdělen mezi více nábojových stavů, což může snižovat citlivost na spodních koncentracích.
• Funkce SUM MRMs v MSQuan umožnila sloučení vybraných MRM kanálů (např. M-7, M-8, M-9) do jednoho „sum“ datového kanálu, který je následně zpracován jako běžný MRM. Kombinovaný kanál poskytl robustnější kalibrační křivku a zvýšenou citlivost, ilustrovanou zobrazením extrahovaného signálu pro 0.5 ng/mL vzorek po extrakci.
• Hlavní mechanismus přínosu je eliminace variability způsobené posunem rozložení nábojových stavů (který závisí na koncentraci a chemii mobilní fáze), protože suma signálu neztrácí informaci rozptýlenou mezi jednotlivými nábojovými deriváty.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení citlivosti analýzy díky sloučení signálů z více nábojových stavů; lepší detekce nízkých koncentrací biologických léků.
• Zvýšení robustness a přesnosti kvantifikace napříč širokým dynamickým rozsahem (0.1–1000 ng/mL v příkladu).
• Zjednodušení datového zpracování a rychlejší evaluace metod díky integrované SUM MRM funkci; možnost testovat různé kombinace kanálů bez potřeby manuálního slučování.
• Praktické využití v preklinickém i klinickém vývoji bioterapeutik, včetně oligonukleotidů, peptidů, mAb a ADC, pro farmakokinetiku, toxikologii a podporné bioanalytické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření přístupu pro multiplexní stanovení více bioterapeutik současně, kde každý analyte generuje více nábojových stavů.
• Integrace výběru optimálních MRM skupin s nástroji strojového učení pro automatizované rozhodování které kanály sčítat pro nejlepší citlivost a přesnost.
• Kompatibilita s vysokorychlostními a vysoce výkonnými LC metodami a aplikace pro velké soubory dat v terénu regulované bioanalytiky.
• Možné kombinace s vysoce přesnou orbitrap/FT-MS detekcí pro potvrzovací studie a určení struktury produktů rozkladu nebo metabolitů.
• Standardizace workflow (SOP) pro regulatorní aplikace, včetně validace sumovaných MRM kanálů podle požadavků GLP/GCP.

Závěr

Součet signálů z více MRM kanálů reprezentujících různé nábojové stavy analytu je praktické a efektivní řešení pro zvýšení citlivosti a robustness kvantitativních LC-MS/MS analýz bioterapeutik. Implementace této strategie v softwaru waters_connect MSQuan umožňuje jednoduché vytvoření konsolidovaných kalibračních křivek a nabízí rychlé nástroje pro optimalizaci metodiky. Případová studie s nusinersenem ilustruje zlepšení detekce v nízkých koncentracích a stabilitu kalibrace napříč širokým rozsahem koncentrací.

Reference

1. Klont F, Hopfgartner G. Mass spectrometry-based approaches and strategies in bioanalysis for qualitative and quantitative analysis of pharmaceutically relevant molecules. Drug Discov Today Technol. 2021;40:64–68. doi:10.1016/j.ddtec.2021.10.004.
2. Sleumer B, Kema IP, van de Merbel NC. Quantitative bioanalysis of proteins by digestion and LC-MS/MS: the use of multiple signature peptides. Bioanalysis. 2023;15(19):1203–1216. doi:10.4155/bio-2023-0129.
3. Kumar D, Sharma M, Trivedi N. A Roadmap guide on bioanalysis challenges and practical solutions for accurate quantification of oligonucleotide-based novel therapeutic modalities using LC-MS. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2026 Feb 1;1270:124900. doi:10.1016/j.jchromb.2025.124900.
4. Tang L, Swezey RR, Green CE, Mirsalis JC. Enhancement of sensitivity and quantification quality in the LC-MS/MS measurement of large biomolecules with sum of MRM (SMRM). Anal Bioanal Chem. 2022;414(5):1933–1947. doi:10.1007/s00216-021-03829-z.
5. Twohig M, Doneanu C, Lee M, Tanna N, Trudeau M. Analytical Solutions and Method Development Considerations for Quantitative Bioanalytical Oligonucleotide Studies. Waters Application Note. 2025.
6. Plumb R. A Streamlined Workflow for Quantitative Bioanalysis using waters_connect for Quantitation Software: A Case Study Using Gefitinib. Waters Application Note. 2025.