Comprehensive Workflow for the Quantification of Peptides and Proteins in Plasma: Semaglutide a Case Study

Význam tématu

Analytická kvantifikace peptidů a proteinů v plazmě je klíčová pro objasnění farmakokinetiky moderních biologických léčiv, jako je semaglutid. Tyto molekuly se v organismu vyskytují v nízkých koncentracích (nmol/l nebo nižších), a proto vyžadují vysoce citlivé a selektivní metody pro přesné stanovení eliminační fáze a biologické dostupnosti.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout robustní workflow pro kvantifikaci peptidového agonisty GLP-1 semaglutidu v lidské plazmě pomocí LC-MS/MS. Práce zahrnovala automatizovanou selekci a optimalizaci MRM přechodů prostřednictvím MassLynx-Skyline Interface a využití povrchově upravené chromatografie ACQUITY Premier a extrakce pomocí Oasis MAX SPE.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byla použita pevná fáze Oasis MAX µElution SPE 96-well deska s interním standardem liraglutidem. Extrakty byly eluovány do QuanRecovery desek pro minimalizaci nespecifické adsorpce.

• UPLC systém: ACQUITY Premier UPLC s kolonkou Peptide CSH C18 2.1×50 mm, 1.7 µm, 65 °C
• Mobilní fáze: A–0,1 % kyselina mravenčí ve vodě, B–0,1 % kyselina mravenčí v acetonitrilu, gradient 30–65 % B za 4,7 min
• MS detektor: Xevo TQ Absolute, ESI pozitivní, desolvační teplota 600 °C, 1000 L/h
• Software: MassLynx v4.2, TargetLynx v4.2, MassLynx-Skyline Interface (MSI)

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla dolní mez detekce (LLOQ) 0,2 ng/mL se vztahu linearity 0,2–100 ng/mL (R2=0,9985) a signál-šum >5:1. Optimalizovaný MRM přechod byl identifikován jako 1029,25 → 1238 (4+) po vyhodnocení 60 kombinací iontů, kolizní energie a kuželového napětí. Povrchová technologie MaxPeak HPS eliminovala nespecifické vázání, což se projevilo ostrými a reprodukovatelnými chromatografickými píky bez carry-over a matricových interferencí.

Opakovatelnost (CV <10,6 %) a přesnost (>90 %) na úrovni QC vzorků prokázaly robustnost metody pro fit-for-purpose bioanalýzu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Ekonomický a časově úsporný vývoj MRM přechodů díky automatizaci
• Vysokou citlivost pro monitorování eliminační fáze peptidů
• Čisté extrakty a zvýšenou návratnost analytu pro spolehlivé PK studie

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj automatizovaných softwarových nástrojů pro velké molekuly a rozšíření workflow na jiné biologické léky. Integrace vysokopropustných platform, miniaturizace vzorkování a pokročilé povrchové úpravy pro další eliminaci nespecifických interakcí mohou dále zlepšit citlivost a efektivitu bioanalytických metod.

Závěr

Popsaný komplexní workflow spojuje moderní chromatografii s výkonnou MS/MS analýzou a softwarovou automatizací, což umožňuje spolehlivou kvantifikaci semaglutidu v plazmě při sub-ng/mL úrovních. Metoda splňuje požadavky na citlivost, přesnost i reprodukovatelnost pro preklinické a rané klinické studie.

Reference

• Wang L, Wang N, Zhang W, Cheng X, Yan Z, Shao G, Wang X, Wang R & Fu C. Therapeutic Peptides: Current Applications and Future Directions. Sig Transduct Target Ther. 2022;7(48).
• Nauck MA, Meier JJ. Pioneering Oral Peptide Therapy for Patients With Type 2 Diabetes. Lancet Diabetes Endocrinol. 2019;7:500–502.
• Overgaard RV, Delff PH, Petri KCC, Anderson TW, Flint A, Ingwersen SH. Population Pharmacokinetics of Semaglutide for Type 2 Diabetes. Diabetes Ther. 2019;10(2):649–662.
• Tanna N, Dunning C & Molloy BJ. MassLynx-Skyline Interface (MSI) – Automated Tool to Streamline MRM Method Development for Large Molecule Quantification. Waters Application Note. 2020.