Comprehensive Workflow for the Quantification of Peptides and Proteins in Plasma: Semaglutide– a Case Study

Význam tématu

Počet biofarmak na bázi peptidů a proteinů v klinickém použití roste, přičemž semaglutid, agonista GLP-1 receptoru, představuje významný terapeutický nástroj v léčbě diabetu 2. typu a obezity. Nízké koncentrace v plazmě vyžadují vysoce citlivé kvantitativní metody pro přesné stanovení farmakokinetiky.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo navrhnout a ověřit komplexní workflow pro kvantifikaci semaglutidu v lidské plasmě pomocí LC-MS/MS s dosažením LLOQ 0,2 ng/mL. Studie demonstruje optimalizaci MRM přechodů, přípravu vzorku a chromatografii s vysokou reprodukovatelností.

Použitá metodika

• Příprava kalibrační křivky (0,2–100 ng/mL) a QC vzorků v plazmě.
• Proteinová precipitace metanolem (2:1), vnitřní standard liraglutid 0,5 ng/mL.
• Čištění SPE pomocí Oasis MAX µElution desek, eluace do QuanRecovery destiček.
• Chromatografie na Peptide CSH C18 kolonce (2,1 × 50 mm, 1,7 µm), 65 °C, gradient 30–65 % B za 4,7 min, 0,4 mL/min.
• Optimalizace MRM přechodů ve waters_connect Software, vyhodnoceno 25 kombinací přenašeč-fragment–energií.

Použitá instrumentace

• Xevo TQ Absolute Mass Spectrometer
• ACQUITY Premier UPLC System
• Oasis MAX µElution SPE Plates
• Waters QuanRecovery 96 well Plates
• ACQUITY Premier Peptide CSH C18 Column
• waters_connect for Quantitation Software

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární rozsah 0,2–100 ng/mL (R2=0,9985) s LLOQ 0,2 ng/mL (S/N>5). Optimální MRM přechod odpovídal iontu [M+4H]4+ 1029,25→1238. Vzorky vykázaly symetrické píky bez nepotřebných vazeb, %CV <4 % a přesnost >90 %. Žádné carryover nebo interferenční signály v blanku nebyly zjištěny.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost pro sledování farmakokinetiky semaglutidu v eliminaci.
• Zkrácení času vývoje díky automatizované optimalizaci MRM přechodů.
• Minimalizace ztrát peptidů díky HPS povrchovým technologiím.
• Robustní reproducibilita vhodná pro preklinické i klinické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření workflow na další peptidové a proteinové léky.
• Integrace s vysokým rozlišením MS a automatickými platformami.
• Další zlepšení povrchových technologií pro snížení absorpce analyzovaných látek.
• Vývoj multi-analyzových panelů pro komplexní bioanalýzu.

Závěr

Navržený LC-MS/MS postup pro semaglutid splňuje požadavky na citlivost, přesnost a reprodukovatelnost, s LLOQ 0,2 ng/mL. Automatizovaná optimalizace MRM a HPS technologie přispěly k efektivnímu vývoji a robustnímu provozu bioanalytické metody.

Reference

• 1. Wang L, Wang N, Zhang W et al. Therapeutic peptides: current applications and future directions. Sig Transduct Target Ther. 2022;7:48.
• 2. Nauck MA, Meier JJ. Pioneering oral peptide therapy for patients with type 2 diabetes. Lancet Diabetes Endocrinol. 2019;7:500–502.
• 3. Overgaard RV et al. Population Pharmacokinetics of Semaglutide for Type 2 Diabetes. Diabetes Ther. 2019;10(2):649–662.
• 4. Bracchiglione J et al. Semaglutide for adults living with obesity. Cochrane Database Syst Rev. 2025;10:CD015092.
• 5. DeLano M et al. Using Hybrid Organic–Inorganic Surface Technology to Mitigate Analyte Interactions with Metal Surfaces in UHPLC. Anal Chem. 2021;93(14):5773–5783.