The Important Contribution of Glucuronide Metabolite Hydrolysis to Detection and Quantitation in Urine Drug Testing

Důležitý přínos hydrolýzy glucuronidových metabolitů pro detekci a kvantifikaci v moči

Význam tématu

Glukuronidace je hlavní cestou fáze II metabolizmu mnoha léčiv a psychoaktivních látek; často převažuje nad volnou (nekonjugovanou) formou v moči. Pokud laboratorní metody měří pouze volné analyty, může docházet k zásadnímu podhodnocení expozice a k falešně negativním výsledkům. Proto má pochopení a optimalizace enzymatické hydrolýzy (β-glukuronidázou) přímý dopad na citlivost, kvantitu a interpretační hodnotu urine drug testing v klinické i forenzní praxi.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo kvantifikovat, do jaké míry přispívá hydrolýza rekombinantní β-glukuronidázou ke zvýšení detekce a celkové kvantifikace léků a jejich metabolitů ve vzorcích moči pacientů urgentního příjmu. Analýza rozšířila dříve publikovaná data u 400 pacientů a zahrnovala paralelní testování se a bez hydrolýzy pro panel 110 analytů (z nichž 76 vykázalo pozitivní nálezy při hydrolýze). Studie sledovala jak kvalitativní (detekce/falešné negativity), tak kvantitativní dopady hydrolýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika

• Sběr: moče od 400 pacientů ED, studie schválena místní komisí pro lidské studie.
• Panel: 110 látek zahrnujících rodičovské látky a fáze I metabolity; kvantifikace pro 104 analytů pomocí metody Threshold Accurate Calibration (TAC) a doplňkově isomer‑specifická metoda pro kanabinoidy.
• Hydrolýza: rekombinantní směs β‑glukuronidáz (IMCSzyme RT) obsahující dvě varianty optimalizované pro široké pokrytí O‑ i N‑glukuronidů; analýzy provedeny se a bez hydrolýzy.
• Příprava vzorků: TAC metoda s maticovou normalizací a 10× ředěním negativní močí pro dosažení požadovaného analytického rozsahu.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Waters ACQUITY UPLC I‑Class PLUS (Flow‑Through Needle)
• MS: Waters Xevo TQD tandemový hmotnostní spektrometr
• Kolony: ACQUITY UPLC BEH Phenyl 1.7 µm (2.1×50 mm) pro TAC; Cortecs UPLC C18+ 1.6 µm (2.1×50 mm) pro kanabinoidy
• Mobilní fáze: amonium formiát + formiová kyselina v H2O / methanolu nebo acetonitrilu dle metody
• Enzymatický reagens: IMCSzyme RT (rekombinantní β‑glukuronidázy, Irmo, SC)

Hlavní výsledky a diskuse

• Rozsah pozitivních nálezů: Ze 360 vzorků s pozitivním výsledkem bylo po hydrolýze identifikováno 1 866 specifických pozitivit pokrývajících 76 analyzovaných látek.

• Podíl konjugovaných forem: U 39 ze 76 analyzovaných látek přispívala hydrolýza více než 50 % ke signálu; u 24 analyzátů (≈32 %) byla glukuronidovaná forma dominantní (>80 %). To zahrnovalo reprezentanty kanabinoidů, benzodiazepinů, opioidů a psychiatrických léků.

• Detekční citlivost: Detekční míra bez hydrolýzy klesala prudce u analytů, kde volná forma tvořila <40 % celkového signálu. Pro ~10 % analytů byla detekční míra bez hydrolýzy v rozsahu 0–20 %; tedy hydrolýza byla kritická pro odhalení užívání.

• Falešné negativity: Bez hydrolýzy vykázalo 39 analytů falešné negativní výsledky; 16 z nich mělo míru falešných negativ >50 %. Čtyři látky měly 100% falešnou negativitu bez hydrolýzy: cannabidiol, α‑hydroxy alprazolam, 11‑hydroxy‑THC a buprenorfin.

• Kvantifikace: U 39 analytů hydrolýza přispívala >50 % k měřené koncentraci. U přibližně 16 analytů došlo bez hydrolýzy k poklesu koncentrace o >99 %. Pokles mediánu koncentrace bez hydrolýzy koreloval lineárně s procentem glukuronidace (regrese: sklon ≈1,09; intercept ≈‑4,4), tj. čím vyšší podíl konjugátu, tím větší kvantitativní underestimate bez hydrolýzy.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení citlivosti: Implementace optimalizované rekombinantní hydrolýzy významně snižuje riziko falešných negativních nálezů u mnoha lékových tříd.
• Spolehlivá kvantifikace: Hydrolýza umožňuje přesnější odhad celkové exkrece analytu, což je důležité pro interpretaci farmakokinetiky, compliance a forem užívání.
• Metodická robustnost: Použití rekombinantních enzymových směsí poskytuje konzistentnější a širší substrátové pokrytí než tradiční zdroje enzymů (např. Helix pomatia nebo Escherichia coli).

Praktická doporučení pro laboratoře

• Validovat hydrolýzu konkrétními analyty v panelu (zahrnout N‑glukuronidy, které bývají odolnější).
• Vyhodnotit a standardizovat podmínky (doba, teplota, poměry enzym/vzorek) a kontrolovat účinnost hydrolýzy kontrolními materiály.
• Upravovat interpretační limity a reporting tak, aby zohledňovaly rozdíly mezi volnou a celkovou (po‑hydrolýze) koncentrací.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozvoj rekombinantních a inženýrských β‑glukuronidáz s širším spektrem aktivity a zvýšenou účinností pro N‑glukuronidy.
• Směrování k analytickým přístupům, které umožní přímé rozlišení a kvantifikaci konjugovaných forem bez nutnosti hydrolýzy (např. vysoce selektivní HRMS metody, multiparalelní přesné transizní přístupy).
• Automatizace enzymatického kroku v rámci workflow UHPLC‑MS/MS a integrace kontrol účinnosti hydrolýzy do QA systémů.
• Větší důraz na isomer‑specifické metody (např. pro kanabinoidy) a robustní maticové normalizační techniky pro zlepšení kvantitativní přesnosti v heterogenních klinických maticích.
• Využití dat z reálné klinické praxe (velké kohorty) pro kalibraci interpretačních algoritmů a pro zlepšení rozhodovacích pravidel v urgentní a forenzní medicíně.

Závěr

Studie ukazuje, že enzymatická hydrolýza glucuronidů má zásadní vliv na citlivost i kvantitativní výstupy urine drug testing. Bez adekvátní hydrolytické konverze mnoho analytů uniká detekci nebo je významně podhodnoceno v měřené koncentraci. Implementace optimalizovaných rekombinantních β‑glukuronidáz a systematické ověřování účinnosti hydrolýzy by měla být součástí standardního workflow laboratoří provádějících definitní LC–MS/MS testování drog v moči.

Reference

• D’Ovidio C, Locatelli M, Perrucci M et al. LC‑MS/MS Application in Pharmacotoxicological Field: Current State and New Applications. Molecules. 2023;28:2127‑39. doi: 10.3390.
• Liston HL, Markowitz JS, DeVane CL. Drug Glucuronidation In Clinical Psychopharmacology. J Clin Psychopharmacol. 2001;21(5):500‑515. PMID: 11593076.
• Johnson‑Davis K. Opiate & Benzodiazepine Confirmations: To Hydrolyze or Not to Hydrolyze is the Question. J Appl Lab Med. 2018;2:564‑572. doi: 10.1373/jalm.2016.022947.
• Smith HS. Metabolism and Disposition of Prescription Opioids: a Review. Pain Physician. 2012;15(3 Suppl):ES133‑ES150. PMID: 26227254.
• French D, Wu AH, Lynch KL. Hydrophilic interaction LC–MS/MS Analysis of Opioids in Urine: Significance of Glucuronide Metabolites. Bioanalysis. 2011;3(23):2603‑2612. doi:10.4155/bio.11.259. PMID: 22136049.
• Matsuo T, Ogawa T, Iwai M, et al. Development of an LC–MS/MS Method for the Determination of Five Psychoactive Drugs in Postmortem Urine by Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Glucuronide Conjugates. Forensic Toxicol. 2024;42(2):181‑190. doi:10.1007/s11419‑023‑00690‑7. PMID: 38557936.
• Dinga Y, Peng M, Zhang T. Quantification of Conjugated Metabolites of Drugs in Biological Matrices After the Hydrolysis with β‑glucuronidase and Sulfatase: A Review of Bio‑Analytical Methods. J Chromatogr B. 2013;925:38‑50. PMID: 23649485.
• Wakabayashi M, Fishman WH. Comparative Ability of β‑glucuronidase Preparations to Hydrolyze Certain Steroid Glucosiduronic Acids. Biochim Biophys Acta. 1961;48:198‑199. PMID: 13782588.
• Southworth MJ, et al. Morphine Glucuronide Hydrolysis: Superiority of β‑glucuronidase from Patella Vulgata. Pharmacology. 1982;28:83‑86. PMID: 6799227.
• Namera A, Saito T, Nagao M. Investigation of Commercially Available Recombinant and Conventional β‑glucuronidases to Evaluate the Hydrolysis Efficiencies Against O‑ and N‑glucuronides in Urinary Drug Screening. Forensic Toxicol. 2025;43:356‑364. doi:10.1007/s11419‑025‑00715‑6.
• Lee LA, McGee AC, Sitasuwan P et al. Factors compromising glucuronidase performance in urine drug testing potentially resulting in false negatives. J Anal Toxicol. 2022;46(6):689‑696. PMID: 34401904.
• Cone EJ, Yousefnejad D, Darwin WD et al. Incomplete Recovery of Prescription Opioids in Urine Using Enzymatic Hydrolysis of Glucuronide Metabolites. Drug Metab Dispos. 2007;35(4):649‑654. PMID: 17132254.
• Klette KL, McMillin GA, Koons TL et al. Comparison of Purified β‑glucuronidases in Patient Urine Samples Indicates a Lack of Correlation Between Enzyme Activity and Drugs of Abuse Metabolite Hydrolysis Efficiencies Leading to Potential False Negatives. J Anal Toxicol. 2018;43(3):221‑227. PMID: 30517702.
• Zhang X, Sitasuwan P, Horvath G et al. Increased activity of β‑glucuronidase Variants Produced by Site‑Directed Mutagenesis. Enzyme Microb Technol. 2018;109:20‑24. doi:10.1016/j.enzmictec.2017.09.005.
• Schlachter CR, McGee AC, Sitasuwan PN, et al. Variants of Glycosyl Hydrolase Family 2 β‑glucuronidases have Increased Activity on Recalcitrant Substrates. Enzyme Microb Technol. 2021;145:109742. doi:10.1016/j.enzmictec.2020.109742.
• Rosano TG, Islam SMT, Rumberger JM et al. Definitive urine drug testing in emergency medicine: Recreational and psychiatric drug findings. J Mass Spectrom Adv Clin Lab. 2025;37:16‑27. doi:10.1016/j.jmsacl.2025.04.008.
• Rosano TG, Rumberger JM, Scholz KL et al. Novel Matrix Normalization Technique for Accurate LC‑ESI‑MS/MS Detection and Quantification of Drugs and their Metabolites in Toxicology Research and Practice. Current Protocols. 3, e644.
• Rosano TG, Rumberger JM, Wood M. Matrix Normalization Techniques for Definitive Urine Drug Testing. J Anal Toxicol. 2021;45:901‑912.
• Rosano TG, Ohouo PY, Wood M. Screening and Quantification of 64 Drugs and Metabolites in Human Urine using UPLC‑MS‑MS Analysis with Threshold Accurate Calibration. J Anal Toxicol. 2017;41:536‑546.
• Rosano TG, Cooper J, Scholz KL, Wood M. Confirmation of Cannabinoids in Forensic Toxicology Casework by Isomer‑Selective UPLC‑MS/MS analysis. J Anal Toxicol. 2023;47:709‑718. doi:10.1093/jat/bkad048.
• Rosano TG, Rumberge JM, Konetchy RM et al. Direct‑to‑definitive Urine Drug Testing Panel with Addition of xylazine and 4‑hydroxy xylazine Identification and Quantitation. Waters Application Brief. 2025.
• Rosano TG, Cooper JA, Scholz KL et al. Cannabinoid Isomer Identification and Quantitation by UPLC‑MS/MS Analysis in Forensic Urine. Waters Application Brief. 2024.