Direct-to-Definitive Urine Drug Testing Panel with Addition of Xylazine and 4-Hydroxy Xylazine Identification and Quantitation

Význam tématu

Xylazin je nepříto-opioidní tlumič centrálního nervového systému s veterinárním využitím jako sedativní anestetikum a svalový relaxant. Jeho rostoucí zneužívání u lidí a objevování v případech předávkování opioidními látkami nebo jako příměs v nelegálních drogách klade vysoké nároky na rozšířený toxikologický screening.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo rozšířit existující UHPLC-MS/MS panel pro 102 toxikologicky relevantních látek v moči o detekci a kvantifikaci xylazinu a jeho hlavního metabolitu 4-hydroxyxylazinu. Studie popisuje aktualizaci metody, nastavení kalibrace a validaci nových analyzovaných látek.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Matrix normalization TAC (Threshold Accurate Calibration) – dvojitá analýza vzorku „nepravý“ vs. „s přídavkem“ referenčních standardů.
• Enzymatická hydrolýza β-glukuronidázou pro uvolnění konjugátů.
• Automatizace pipetáže 20 μl vzorku, kalibrátorů a QC do 96jamkové plate, přidání hydrolytického reakčního roztoku, inkubace 1 h při 55 °C.
• Chromatografie na fenylové kolóně ACQUITY UPLC BEH Phenyl (1,7 μm, 2,1×50 mm) s gradientem 2–90 % organiky (methanol s 0,1 % kyseliny mravenčí).
• MRM akvizice v režimu ESI pozitivní s cílenými přechody pro každý analyte.

Instrumentace:

• Waters ACQUITY UPLC I-Class PLUS System (FTN).
• Waters Xevo TQD Mass Spectrometer.
• MassLynx 4.1 a TargetLynx XS k vyhodnocení TAC poměru a kvantifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

• Retention times: xylazin 1,63 min; 4-hydroxyxylazin 1,33 min.
• Precision (CV) 6,8–10,1 %; bias -11,5 až -2,2 %.
• Lineární kalibrace R2 0,994–1,000 v rozmezí 38–500 ng/ml.
• LOD 10 ng/ml s TAC poměrem výrazně nad šumovou úrovní.
• Carryover <3 %; matrix effects 7–18 % ion enhancement (CV 10–13 %).
• Procesní stabilita po 18 h: recovery 90–111 % pro xylazin, 91–103 % pro metabolit.
• Reálné forenzní případy: xylazin 58–3860 ng/ml, 4-hydroxyxylazin

Přínosy a praktické využití metody

• Integrovaný screening >100 látek v jediném běhu.
• Vysoká reprodukovatelnost a potlačení vlivu matrice díky TAC.
• Rychlá forenzní a klinická aplikace pro sledování zneužívání xylazinu.
• Detekce adulterací nelegálních vzorků a monitoring kombinací s opioidy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze dále rozšířit o nové látky a isotopické interní standardy, zvýšit stupeň automatizace přípravy vzorků a integraci s laboratorními informačními systémy. Potenciál je ve využití v dopravní toxikologii, pracovnělékařských programech a epidemiologických studiích.

Závěr

Aktualizovaný UHPLC-MS/MS panel s TAC normalizací úspěšně zahrnuje xylazin a 4-hydroxyxylazin. Validace potvrdila vysokou přesnost, linearitu i stabilitu metody. První forenzní aplikace prokázaly její spolehlivost a význam pro rozšířený toxikologický screening.

Reference

1. Kacinko SL et al. Journal of Analytical Toxicology. 2022;46:911–917.
2. Cano M et al. JAMA Network Open. 2024;7:e2350630.
3. Gupta R et al. New England Journal of Medicine. 2023;388:2209–2212.
4. White House Office of National Drug Control Policy. Fentanyl adulterated with xylazine Response Plan. 2023.
5. Rock KL et al. Journal of Forensic and Legal Medicine. 2023;97:102542.
6. Canadian Centre on Substance Use and Addiction. CCENDU drug alert: Xylazine. 2022.
7. EMCDDA. European Drug Report 2023. Lisbon.
8. Teoh WK et al. Australian Journal of Forensic Sciences. 2022;55:708–719.
9. Rosano TG et al. Current Protocols. 2022;3:e644.
10. ANSI/ASB Standard 036. Standard Practices for Method Validation in Forensic Toxicology. 2019.
11. Wadsworth Center. NYS Clinical Laboratory Standards. 2024.