A Simplified, Mixed-Mode Sample Preparation Strategy for Urinary Forensic Toxicology Screening by UPLC-MS/MS

Význam tématu

Ve forenzní toxikologii je rychlé a spolehlivé sledování široké škály drog a jejich metabolitů v moči klíčové pro screening a potvrzování výsledků. Správná příprava vzorku minimalizuje matrické efekty, prodlužuje životnost chromatografické kolony a zvyšuje citlivost a přesnost LC-MS/MS analýz.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této studie bylo navrhnout zjednodušenou, rychlou a vysoce účinnou strategii přípravy vzorků pro forenzní screening 38 běžných látek (opiáty, stimulanty, benzodiazepiny a další) v moči. Metoda kombinuje in-well enzymatickou hydrolýzu, konzolidovaný SPE proces a UPLC-MS/MS analýzu, přičemž celý proces trvá méně než 30 minut.

Použitá metodika a instrumentace

Všechny analytické kroky byly provedeny v 96-jamkových Oasis MCX µElution destičkách:

• In-well hydrolýza: 50 µL moči, 50 µL 0,5 M NH4Ac pufru a 10 µL β-glukuronidázy.
• Acidifikace: 200 µL 4 % H3PO4.
• Nabití na sorbent pod vakuem a jediný mycí krok: 200 µL 20% MeOH s 0,02 N HCl.
• Eluce: 2×50 µL ACN:MeOH (60:40) s 5 % NH4OH.
• Evaporace pod dusíkem, rekonstituce v 50 µL 2% ACN/1% kyseliny mravenčí.

UPLC-MS/MS podmínky:

• LC: ACQUITY UPLC I-Class, kolona BEH Phenyl 1,7 µm (2,1×100 mm), 40 °C, gradient 95:5 → 37,5:62,5 v 5 min, cyklus 6 min.
• MS: Xevo TQD, ESI pozitivní režim, optimalizovaná MRM přechody, MassLynx s TargetLynx.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda poskytla:

• Dobrou retenci a rozlišení i polárních glukuronidovaných metabolitů do 4 minut, včetně baseline separace izobarických párů.
• Extrakční výtěžky >80 % pro 37 z 38 cílových sloučenin (průměr 100 %), CV <10 %.
• Meze detekce v rozmezí 1–10 ng/mL pro jednotlivé látky.
• Zjednodušení SPE workflow ze 6 na 3 kroky a zkrácení doby přípravy celé destičky na 30 minut.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Rychlý a vysoce citlivý screening komplexního panelu drog v moči.
• Úsporu rozpouštědel a nákladů na likvidaci.
• Minimalizaci matrických interferencí a vyšší životnost kolony.
• Omezení rizika zanesení ionizační hlavy a snížení odstávek instrumentu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné rozšíření a další vývoj:

• Přímá analýza glukuronidovaných metabolitů bez hydrolýzy díky BEH Phenyl chromatografii.
• Automatizace workflow pro vysokokapacitní forenzní a klinické laboratoře.
• Integrace s HRMS pro neznámé a nové analyty.
• Další optimalizace mikroeluce a minimalizace objemů rozpouštědel.

Závěr

Navržená metoda kombinuje in-well enzymatickou hydrolýzu, zjednodušené SPE a rychlou UPLC-MS/MS analýzu pro 38 forenzně toxikologických cílových látek s vynikajícími extrakčními výtěžky, citlivostí a reprodukovatelností. Proces se zkrátil na polovinu tradičního workflow, přičemž zachovává vysokou kvalitu výsledků.

Reference

1. Danaceau JP, Chambers E, Fountain KJ. Advantages of CORTECS C18 2.7 µm and XBridge Phenyl XP 2.5 µm Columns for the Analysis of a Comprehensive Panel of Pain Management Drugs for Forensic Toxicology. Waters Application Note. 2014; Literature Code 720005185en.
2. Wang P, Stone JA, Chen KH, Gross SF, Haller CA, Wu AH. Incomplete recovery of prescription opioids in urine using enzymatic hydrolysis of glucuronide metabolites. Journal of Analytical Toxicology. 2006 Oct;30(8):570–575.