UPLC™ Separation of Fifteen Bisphenols Using a Waters Acquity™ Biphenyl RP Column with MaxPeak™ Premier Technology and UV Detection

Význam tématu

Monitoring bisfenolů je kritický pro bezpečnost potravin, zdravotní rizika a sledování životního prostředí, protože řada těchto sloučenin vykazuje endokrinní narušující účinky. Rychlé, selektivní a reprodukovatelné analytické metody umožňují efektivní screening širokého spektra bisfenolů v matricích s nízkými koncentracemi a snižují riziko interferencí při detekci pomocí UV nebo hmotnostní spektrometrie. Vývoj chromatografických metod s vysokou selektivitou proto přímo podporuje prostor pro přesné kvantitativní stanovení a širší monitorovací programy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a porovnat UPLC metodu, která dokáže v krátkém čase (řádově minuty) separovat a detekovat 15 strukturově příbuzných bisfenolů. Testovaly se tři reverzně-fázové stacionární fáze (BEH C18, BEH Phenyl, BEH Biphenyl) zabudované do inertního (MaxPeak Premier) hardware s cílem zjistit, která fáze poskytne nejlepší chromatografickou separaci bez nutnosti prodloužení kolon nebo složitých úprav mobilní fáze.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika v kostce:

• Systém: ACQUITY I-Class se sekvenčním PDA detektorem (HPS flowpath); pro identifikaci byl použit také Xevo TQ-S micro MS v negativním ESI (scan 50–500 m/z).
• Kolony: BEH C18 (2.1 x 50 mm, 1.7 µm), BEH Phenyl (2.1 x 50 mm, 1.7 µm), BEH Biphenyl (2.1 x 50 mm, 1.7 µm); inertní hardware s MaxPeak Premier technologií.
• Mobilní fáze: voda (A) / methanol (B), bez aditiv a úpravy pH.
• Gradient: lineární nárůst metanolu přibližně z 50 % na 90 % během ~6,5 min (konečná analýza přibližně 8 min).
• Podmínky: průtok 0,45 mL/min, teplota kolony 25 °C, injekční objem 1,0 µL, vzorek v 75:25 voda:methanol, koncentrace směsi bisfenolů 0,1 mg/mL; detekce UV při 220 nm.
• Replikace: trojité injekce na každé kolonce pro ověření výsledků; určení piků podpořeno MS daty.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kolona s BEH Biphenyl stacionární fází dosáhla baseline separace všech 15 testovaných bisfenolů v průběhu jedné analytické separace trvající přibližně 8 minut.
• BEH C18 vykázala tři dvojice (nebo skupiny) koelucí, tedy nevystačila s chromatografickým rozlišením všech komponent; to by sice částečně vyřešila MS/MRM detekce, avšak riskuje interferenci a složitější kvantifikaci.
• BEH Phenyl správně rozdělila většinu analytů, ale zůstala jedna částečná koeluce; k jejímu plnému rozlišení by pravděpodobně byl nutný delší sloupec nebo delší analýza.
• Mechanisticky poskytuje biphenyl ligand navíc posílené π–π interakce mezi fenylovými částmi stacionární fáze a aromatickými jádry bisfenolů, čímž zvyšuje selektivitu pro sloučeniny s podobnou hydrofobicitou, které by se na C18 lišily jen velmi málo.
• Absence pufrů nebo iontových aditiv v mobilní fázi ukázala, že adekvátní selektivitu lze dosáhnout čistě změnou ligandové chemie bez kompromisů v jednoduchosti mobilní fáze.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý screening a kvantifikace širokého spektra bisfenolů v potravinách a environmentálních vzorcích s vysokou propustností (short 2.1 x 50 mm kolony).
• Chromatografické rozlišení všech analytů snižuje závislost na MS selektivitě a minimalizuje riziko křížových interferencí při kvantifikaci, což zjednodušuje validaci a provoz v rutinních laboratořích.
• Možnost detekce UV (220 nm) poskytuje nákladově efektivní alternativu nebo doplněk k MS, vhodnou pro screeningové laboratoře s omezeným přístupem k hmotnostní spektrometrii.
• Metoda je kompatibilní s inertním hardwarem (MaxPeak Premier), což zvyšuje odolnost proti adsorpci a zlepšuje opakovatelnost pro analyty náchylné k ztrátám na stěnách průtoku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření souborů analyzovaných bisfenolů včetně konjugovaných a derivátů a jejich začlenění do rutinních monitorovacích panelů.
• Integrace biphenyl kolony s cílenými MS/MS metodami (MRM) pro zvýšení citlivosti a selektivity při nízkých hladinách v komplexních matricích.
• Vývoj zelenějších gradientů a zmenšení spotřeby organických rozpouštědel při zachování rozlišení (např. optimalizace gradientních profilů, vyšší účinnost sloupce při nižším spotřebiči).
• Možnosti nasazení 2D-LC nebo multi-modalních separací pro extrémně komplexní vzorky a využití ion-mobility nebo HRMS pro potvrzující analýzu.
• Standardizace a validace metody podle regulačních požadavků pro rutinní analýzy v potravinářství a environmentální chemii.

Závěr

Použití BEH Biphenyl stacionární fáze v inertním UPLC systému umožnilo rychlou a spolehlivou chromatografickou separaci 15 bisfenolů bez nutnosti prodloužení kolony nebo přidání složitých mobilních fázových aditiv. Zvýšené π–π interakce biphenyl ligandů poskytují výrazně lepší selektivitu pro aromatické bisfenoly než tradiční C18 nebo jednofenylové fáze. Metoda nabízí praktický přínos pro rychlý screening a kvantifikaci v potravinové a environmentální analytice a snižuje provozní závislost na sofistikované MS selektivitě.

Použitá instrumentace

• ACQUITY UPLC I-Class systém (ACQUITY I-Class System) s PDA (Tunable UV) detektorem, HPS flowpath (inertní flowpath MaxPeak Premier).
• Xevo TQ-S micro Triple Quadrupole Mass Spectrometer, negativní ESI, scan 50–500 m/z (použito pro identifikaci špiček).
• Kolony: ACQUITY Premier BEH C18 2.1 x 50 mm, 1.7 µm; ACQUITY Premier BEH Phenyl 2.1 x 50 mm, 1.7 µm; ACQUITY Premier BEH Biphenyl 2.1 x 50 mm, 1.7 µm.

Reference

1. ECHA. Bisphenols – ECHA hot topics. (Accessed 7 Jan 2026).
2. Saal F, Vandenberg L. Update on the Health Effects of Bisphenol A: Overwhelming Evidence of Harm. Endocrinology. 162 (2020): 1–25.
3. Eladak S, Grisin T, Moison D, et al. A New Chapter in Bisphenol A Story: Bisphenol S and Bisphenol F are not safe alternatives to this compound. Fertility and Sterility. 103 (2015): 11–21.
4. Hong P, McConville P. A Complete Solution to Perform a Systematic Screening Protocol for LC Method Development. Waters White Paper. 720005268.
5. Berthelette K, Aiello M, Collins C, Walter TH. Development of a UPLC Method for a Forced Degradation Study of Radioligand Therapy Precursor PSMA-617. Waters Application Note. 720009042, September 2025.
6. Dolan J. Stability Indicating Assays. LCGC North America. 20 (4) (2002): 346–349.
7. Shah B, Jain S, Prajapati K, Mansuri N. Stability Indicating HPLC Method Development: A Review. International Journal of Pharmacy Sciences. 3 (2012): 2978–2988.
8. Croes K, Steffens A, Marchand DH, Snyder LR. Relevance of π–π and dipole-dipole interactions for retention on cyano and phenyl columns in reversed-phase liquid chromatography. Journal of Chromatography A. 1098 (2005): 123–130.
9. Sun Y, Sun Z, Wang C, Wei Y. Effect of phenyl numbers in polyphenyl ligand on retention properties of aromatic stationary phases. Journal of Chromatography A. 1674 (2022): 463152.
10. Taniguchi A, Hirose T, Shimotsuma M. Retention and Selectivity Differences due to Molecular Structure of Phenyl-Type Reversed-Phase HPLC Columns. Chromatography. 46 (2025): 55–61.