Extraction and Analysis of Orthocetamol, Metacetamol and Paracetamol in Human Plasma Using Oasis™ PRiME HLB and Waters ACQUITY™ Biphenyl RP Column with MaxPeak™ Technology

Význam tématu

Oddělení a kvantifikace pozičních izomerů léčiv a jejich metabolitů má v bioanalytice zásadní význam. Poziční izomery často sdílejí shodné hmotnostně-nabité poměry (m/z) a podobné fyzikálně-chemické vlastnosti, což ztěžuje jejich rozlišení při běžné LC–MS analýze. Spolehlivé chromatografické rozlišení takových sloučenin je nezbytné pro přesné kvantitativní sledování v klinických studiích, toxikologii a farmakovigilanci. Studie ilustruje praktické řešení separace ortocetamolu, metacetamolu a paracetamolu (acetaminofenu) z lidské plazmy kombinací rychlé SPE přípravy vzorku a selektivní biphenylové LC kolony s technologií MaxPeak, čímž adresuje potřebu robustní, reprodukovatelné a vysoce propustné metody pro bioanalytické použití.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout pracovní postup umožňující baseline separaci tří pozičních izomerů acetaminofenu a současně zajistit vysokou návratnost po extrakci z lidské plazmy. Konkrétně autoři ověřili kombinaci Oasis PRiME HLB 2-krokového SPE protokolu pro čistění vzorku a ACQUITY BEH Biphenyl RP kolony s MaxPeak technologií pro chromatografii, detekci proběhla pomocí SIR na 152 m/z. Hodnoceny byly separace, návratnost, matrix efekty a vhodnost postupu pro bioanalytické nasazení.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: směs standardů orto-, meta- a paracetamolu (1 mg/mL každého). Plazma byla spikeována tak, aby konečná koncentrace analyzátů činila 20 µg/mL po 1:1 ředění a konečné úpravě.
• Příprava vzorků: Oasis PRiME HLB 96-well desky (30 mg sorbentu) se 2-krokovým protokolem (load + elute). Před naložením vzorky 1:1 ředěny 4% kyselinou fosforečnou pro zajištění neutrálního stavu analyzátů; eluce vysokým podílem organického roztoku, následné naředění vodou pro kompatibilitu LC.
• Chromatografie: ACQUITY UPLC H‑Class Plus; kolona Waters ACQUITY BEH Biphenyl s MaxPeak Technology, rozměr 2.1 x 50 mm, 1.7 µm; teplota kolony 30 °C; injekční objem 1.0 µL; průtok 0.4 mL/min; mobilní fáze A voda, B methanol, doplněk D 2% kyselina mravenčí udržovaná konstantně na 5% obj.; gradient 5%→95% B během 5.0 min, hold 1 min, reekvilibrace celkem 8 min běhu.
• Hmotnostní detekce: ACQUITY QDa Mass Detector v režimu SIR na 152 m/z, ESI pozitivní, kapilární napětí 1.5 kV, cone voltage 15 V, scan rate 5 pts/s.
• Softwarové zpracování: Empower Chromatography Data System (CDS).

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografické rozlišení: Biphenylová kolona s BEH částicemi a MaxPeak HPS povrchem zajistila baseline separaci všech tří pozičních izomerů s ostrými symetrickými píky během krátkého běhu (8 min). To umožňuje spolehlivé rozlišení izobarických složek, které by MS samotné nerozlišilo.
• Extrakce a návratnost: Oasis PRiME HLB 2-krokový protokol poskytl vysokou návratnost (>90 % pro všechny analyty) a efektivní odstranění fosfolipidů, což vedlo k nízkým matrix efektům a čistým eluátům vhodným pro LC–MS.
• Matrix efekty a selektivita: Prázdná plazma po očistě nevykázala interferující signály při 152 m/z, tedy analyty nebyly endogenně přítomné; SIR režim zvýšil selektivitu a citlivost měření.
• Robustnost: BEH částice a MaxPeak povrchová technologie snižují interakce analyzátů s kovovým hardwarem a zlepšují reprodukovatelnost mezi šaržemi kolony, což je klíčové pro dlouhodobé bioanalytické nasazení.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda je vhodná pro rutinní bioanalytické monitorování acetaminofenu a jeho pozičních izomerů v lidské plazmě, včetně farmakokinetických a toxikologických studií.
• Vysoce propustný formát (96-well SPE) a zkrácený 2-krokový protokol zkracují čas přípravy a jsou kompatibilní s poloautomatizovanými pracovními postupy v klinických laboratořích.
• Eliminace fosfolipidů prodlužuje životnost kolony a snižuje potřebu časté údržby zařízení.
• Baseline separace umožňuje spolehlivou identifikaci izomerů bez potřeby komplikovanější MS/MS nebo HRMS instrumentace, což může snížit náklady a zjednodušit validaci metody.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další validace metody včetně stanovení meze detekce a kvantifikace, přesnosti, přesnosti mezi dny a stability v matrici pro plné bioanalytické nasazení podle regulačních směrnic.
• Rozšíření přístupu na jiné třídy pozičních izomerů a složitější biologické matice; optimalizace wash kroků pro zvýšení selektivity tam, kde je potřeba.
• Integrace s automatizovanými platformami pro vyšší throughput a kompatibilitu s GLP/GMP prostředím.
• Využití tandemového MS nebo HRMS jako doplňku pro potvrzení identit v náročných případech nebo při nízkých koncentracích.

Závěr

Kombinace Oasis PRiME HLB 2-krokového SPE protokolu a ACQUITY BEH Biphenyl RP kolony s MaxPeak technologií poskytuje rychlý, robustní a reprodukovatelný postup pro separaci a analýzu orto-, meta- a paracetamolu v lidské plazmě. Metoda dosahuje baseline separace, vysoké návratnosti a nízkých matrix efektů, což ji činí vhodnou pro bioanalytické i klinické aplikace vyžadující spolehlivé rozlišení izobarických sloučenin.

Reference

1. Tanna N, Plummer C. Oasis PRiME HLB – The Fastest Way to Clean Samples. Waters Application Note. 720008684, 2025.
2. Alkhateeb F, Jenkins K, Rainville P. BEH C18 Batch-to-Batch Robustness for the Analysis of Rosuvastatin and Impurities. Waters Application Note. 720006739, 2020.
3. Walter TH, Yang J. Assessment of the Reproducibility of a C18 Bonded Phase Based on Ethylene-Bridged Hybrid Organic/Inorganic Particles. J. Chromatogr. A, 1716 (2024) 464637. doi: 10.1016/j.chroma.2024.464637.
4. DeLano M, Walter TH, Lauber MA, Gilar M, Jung MC, Nguyen JM, Boissel C, Patel AV, Bates-Harrison A, Wyndham KD. Using Hybrid Organic-Inorganic Surface Technology to Mitigate Analyte Interactions with Metal Surfaces in UHPLC. Anal. Chem. 93 (2021) 5773–5781. doi: 10.1021/acs.analchem.0c05203.
5. Alkhateeb F, Rainville P. Batch-to-Batch Robustness of MaxPeak Premier Columns for the Analysis of Dexamethasone Phosphate and Related Compounds. Waters Application Note. 720007350, 2021.
6. Masike K, Tugizimana F, Ndlovu N, Smit E, Preez L, Dubery I, Madala E. Deciphering the Influence of Column Chemistry and Mass Spectrometry Settings for the Analyses of Geometrical Isomers of L-Chicoric Acid. J Chrom B 1052 (2017) 73–81.
7. Lindner J, Vogeser M, Grimm SH. Biphenyl Based Stationary Phase for Improved Selectivity in Complex Steroid Assays. J Pharm Biomed Anal. 142 (2017) 66–73.
8. Tanna N, Plummer C, Walter TH. Improved Bioanalytical Performance Using a Simplified 2-Step Oasis PRiME HLB Protocol with an Ultra-Short UPLC Column for UPLC-MS/MS. Waters Application Note. 720009018, 2025.