Leveraging Adaptive RT on the Orbitrap Ascend MultiOmics Tribrid mass spectrometer for improved sensitivity and throughput in targeted workflows

Význam tématu

Adaptive RT je moderní algoritmus pro dynamické zarovnávání retenční doby v reálném čase, který odstraňuje nutnost externích spikovaných retenčních standardů a umožňuje použití mnohem užších časových oken při plánovaném akvizičním režimu (PRM). To vede k vyšší citlivosti, lepší datové úplnosti a vyšší propustnosti v cílených proteomických pracovních postupech. Implementace této funkce na platformě Orbitrap Ascend MultiOmics Tribrid umožňuje provádět celý tok od discovery dat až po cílené kvantifikace na jednom spektrometru, což má význam pro vývoj assay, rutinní analýzy v QC i klinicky orientovaný výzkum.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit a demonstrovat využití Adaptive RT na Orbitrap Ascend MultiOmics Tribrid MS (Tune v4.3) pro zvýšení citlivosti a propustnosti v cílených PRM pracovních postupech. Autoři integrovali Adaptive RT jako DIA experiment pro vytvoření lokální referenční souboru (.rtbin) a následně jej použili pro dynamické plánování PRM oken. Studie porovnala použití Ion Trap a Orbitrap detektorů, vyhodnotila opakovatelnost, limity detekce/kvantifikace a odolnost proti posunům retenční doby při 24min gradientu (60 SPD režim).

Použitá instrumentace

• Thermo Scientific Orbitrap Ascend MultiOmics Tribrid mass spectrometer (Tune v4.3)
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC se trap-and-elute konfigurací
• EASY-Spray HPLC Column PepMap RSLC C18, 2 µm, 150 µm × 15 cm (Cat. No. ES906)
• PepMap Neo trap cartridge 5 µm, 300 µm × 5 mm (Cat. No. 174500)
• Thermo Scientific EASY-Spray zdroj
• Software: Proteome Discoverer 3.1 SP1 (s CHIMERYS), Skyline-daily (v24.1.1.398) s PRM Conductor

Použitá metodika

• Vzorky a standardy: Pierce HeLa Digest s PRTC, Biognosys PQ500 peptidový kit a digested plasma matrix. PQ500 byl ředěn do sérií pro stanovení citlivosti.
• LC: 24min metoda (60 SPD) s mobilní fází A: 0,1% FA ve vodě a B: 0,1% FA v 80% acetonitrilu; teplota kolony 45 °C, sampler 7 °C.
• Discovery fáze: gas-phase fractionation (GPF)-DIA experimenty pokrývající 100 m/z segmenty; Ion Trap DIA s 1 Th izolací (turbo scan), Orbitrap DIA s 4 Th izolací (výše rozlišení pro knihovnu).
• Generování referencí: Adaptive RT DIA experiment spuštěný s volbou Acquire reference vytváří .rtbin soubor, který slouží jako referenční mapování retenčních časů pro pozdější Align-to-Reference PRM běhy.
• Targetování: PRM Conductor a Skyline pro tvorbu cílených seznamů z knihovny (PQ500 + 14 PRTC iRT peptidů). Exportované PRM metody byly laděny do širokých a pak úzkých oken.
• Analytické režimy MS: kombinace Ion Trap a Orbitrap detekce pro MS1/MS2; různé nastavení rozlišení (např. Orbitrap 60k/45k/15k/7.5k RP) a rychlosti Ion Trap (Turbo).
• Vyhodnocení: Proteome Discoverer (CHIMERYS) pro GPF-DIA vyhledávání a Skyline pro tvorbu spektrálních knihoven, PRM Conductor pro výběr peptidů a plánování akvizice; výsledky zkušebních ředění pro určení LOD/LOQ a CV%.

Hlavní výsledky a diskuse

• Adaptive RT workflow vytvořil .rtbin soubor z DIA běhu a tento soubor umožnil v reálném čase posouvat plánovaná PRM okna podle aktuální chromatografické situace monitorované driftem backgroundových analytů.
• Narrowing (užší) časová okna díky Adaptive RT vedla k nárůstu dostupného času v injekci na jednotlivý target a tím k vyšší citlivosti bez zvýšení chybějících hodnot (missing values).
• Reprodukovatelnost: median CV přibližně 6 % u finálních assay s Adaptive RT, což ukazuje vysokou stabilitu kvantifikací napříč replikami.
• Kapacita assay: na 24min gradientu (60 SPD) lze přibližně akomodovat ~3 000 kvalifikovaných precursorů v Ion Trap režimu nebo ~2 200 precursorů v Orbitrap režimu v rámci jednoho assay.
• Robustnost vůči posunům RT: Adaptive RT spolehlivě zachytil cíle i při posunech retenční doby až do ~5 minut způsobených změnou průtoku nebo degradací kolony; bez Adaptive RT by při 0,8 min okně docházelo ke ztrátám signálu.
• Citlivost: pro modelový PQ500/plasma assay byla odhadnuta LOD přibližně 2,2 attomolu na kolonu a LOQ přibližně 6,6 attomolu s dobrými hodnotami přesnosti a CV v celé dynamice ředění.

Přínosy a praktické využití metody

• Odstranění nutnosti spikování externích retenčních standardů snižuje čas a náklady při vývoji assay a zjednodušuje rutinní provoz.
• Možnost používat velmi úzká plánovaná okna zvyšuje citlivost (delší akumulační časy na target) a počet simultánně akvizičně dostupných precursorů, což zvyšuje propustnost při zachování datové úplnosti.
• Workflow umožňuje přímé přechody z discovery (GPF-DIA) do cíleného PRM na stejném instrumentu, čímž se zkracuje doba vývoje assay a odstraní se potřeba přenosu mezi platformami.
• Vhodné pro vysoce multiplexované klinické a průmyslové aplikace, kde je požadavek na vysokou citlivost, nízkou variabilitu a minimalizaci chybějících hodnot.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozvoj adaptivních algoritmů může zlepšit prediktivní kapacitu plánování akvizice, např. kombinací s AI/ML modely pro predikci retencí a intenzit.
• Rozšíření Adaptive RT principů na další analytické moduly a platformy (např. jiné typy separací nebo více-dimenzionální chromatografie) pro zvýšení přenositelnosti metod.
• Integrace adaptivního plánování s real-time kvantifikací a rozhodováním (on-the-fly změny akviziční strategie podle kvality signálu) pro ještě efektivnější využití instrumentálních zdrojů.
• Uplatnění v klinických validačních studiích, kde může Adaptive RT snížit potřebu pravidelných kalibrací a přispět k lepší standardizaci výsledků napříč laboratořemi.

Závěr

Implementace Adaptive RT na Orbitrap Ascend MultiOmics Tribrid ukazuje praktický a ověřený postup pro zvýšení citlivosti, reproducibility a propustnosti cílených proteomických assay. Generování lokálního .rtbin referenčního souboru z DIA běhu a následné dynamické plánování PRM oken umožňuje zachytit cíle i při významných chromatografických posunech a zároveň maximalizovat počet monitorovaných precursorů. Tento přístup zkracuje workflow od discovery k cílené analýze a je vhodný pro náročné vývojové i rutinní aplikace.

Reference

1. Remes PM, Yip P, MacCoss MJ. Highly Multiplex Targeted Proteomics Enabled by Real-Time Chromatographic Alignment. Analytical Chemistry. 2020;92(17):11809-11817. doi:10.1021/acs.analchem.0c02075
2. Remes PM, Jacob CC, Heil LR, Shulman N, MacLean BX, MacCoss MJ. Hybrid Quadrupole Mass Filter - Radial Ejection Linear Ion Trap and Intelligent Data Acquisition Enable Highly Multiplex Targeted Proteomics. Journal of Proteome Research. 2024;23(12):5476-5486. doi:10.1021/acs.jproteome.4c00599