New paradigm for plasma proteomics biomarker research

Význam tématu

Targetovaná (PRM/tMSn) proteomika plasmy je klíčová pro verifikaci biomarkerů v translaci a klinickém výzkumu, protože dokáže kvantifikovat nízkoabundantní proteiny v komplexním matrice s vysokým dynamickým rozsahem. Efektivní, škálovatelné a rychlé pracovní postupy umožňují rychlé přechody od kandidátních biomarkerů k verifikaci v reálných souborech vzorků a zrychlují vývoj diagnostických a monitorovacích testů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky bylo demonstrovat robustní a škálovatelný workflow pro verifikaci biomarkerů v plasmatické proteomice pomocí nového Stellar hmotnostního spektrometru (Thermo Scientific). Autoři ukazují kompletní end-to-end postup: od generování nestrukturovaných (unscheduled) PRM metod přes automatizované plánování a zúžení retenčních oken až po zpracování a kvantifikaci více než 570 (a v praxi až 804) peptidů z PQ500 referenční sady během tří dnů, přičemž porovnávají metody s větší propustností (60 SPD, 24 min gradient) a ultra-rychlé (100 SPD, 14 min gradient).

Použitá metodika a instrumentace

Metodika byla postavena na plánovaném PRM (tMSn) s následujícími klíčovými prvky:

• Stellar hybridní kvadrupól-lineární iontový past (Thermo Scientific) s optimalizovanými akvizičními rychlostmi a dynamickými injekčními časy.
• Vanquish Neo UHPLC systém s EASY-Spray ES906A kolonkou (2 μm C18, 150 μm × 15 cm) v trap-and-elute režimu.
• Biognosys PQ500 těžce značených referenčních peptidů pro absolutní kvantifikaci a iRT kalibraci.
• Skyline software (verze 23.1.1.503) pro tvorbu metod a analýzu dat a externí nástroj PRM Conductor pro automatizované filtrování přechodů a generování naplánovaných PRM metod.
• Konfigurace PRM zahrnovala tři po sobě jdoucí experimenty: Adaptive RT DIA pro reálné vyrovnání chromatogramu, full-scan MS pro TIC normalizaci a vlastní tMSn (PRM) se zadáním seznamu prekurzorů.
• HPLC režimy: 60 SPD (24 min gradient) a 100 SPD (14 min gradient) s optimalizovanými retenčními okny (1.8 min při verifikaci, následně 0.6 min pro 60 SPD a 0.35 min pro 100 SPD při finálním plánování).

Postup tvorby metody (třídenní):

1. Den 1 – import PQ500 transition list do Skyline, vytvoření iRT a export nestrukturovaných PRM metod rozdělených do 10 frakcí.
2. Den 2 – běh nestrukturovaných metod na Stellar, import výsledků do Skyline, použití PRM Conductor pro filtrování přechodů a vytvoření široce plánovaných metod s ověřením RT v plazmě.
3. Den 3 – import výsledků široce plánovaných běhů, zúžení RT oken a export finálních naplánovaných PRM metod zahrnujících jak těžké, tak light peptidy pro kvantifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové empirické poznatky a metriky získané v práci:

• Skóre multiplexu: z původních 804 PQ500 peptidů byly po filtrování vytvořeny finální metody obsahující 1 622 prekurzorů s 13 876 (60 SPD) a 13 699 (100 SPD) přechody.
• Počet bodů na chromatografický peak: medián byl 7.1 pro 60 SPD a 6.8 pro 100 SPD; více než 717 peptidů mělo ≥7 bodů/peak, což splňuje Nyquistovo kritérium pro Gaussovské špičky.
• Opakovatelnost: CV pro 10 replik bylo 3.8% (60 SPD) a 4.8% (100 SPD); ~93–94% peptidů mělo CV <20%.
• Senzitivita: LOD a LOQ v rozsahu attomolů; příklad: peptid STVEELHEPIPSLFR měl LOD 5.7 amol a LOQ 17 amol na koloně. Více než 722 peptidů (60 SPD) a 684 peptidů (100 SPD) mělo LOD <50 amol; ~85–87% peptidů mělo LOQ <500 amol.
• Efekt rychlosti: 60 SPD metody (delší gradient) vykázaly přibližně 1.6× nižší LOD/LOQ oproti 100 SPD, ale oba režimy poskytují vysokou citlivost a přesnost.
• Adaptive RT: reálné chromatografické vyrovnání redukovalo výskyt chybějících dat způsobených posuny RT, čímž bylo možné použít úzká plánovaná okna i při velmi vysoké cílové kapacitě.
• Detekce endogenních proteinů: pomocí těžkých peptidů byly identifikovány endogenní peptidy, např. alpha-2-macroglobulin (A2MG), demonstrující schopnost detekovat biologicky relevantní nízkoabundantní proteiny v neat plazmě.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody a možné aplikace:

• Rychlá implementace: kompletní PRM metoda pro stovky cílů sestavena a ověřena během tří dnů bez ručního zpracování v tabulkách.
• Škálovatelnost: použitím Adaptive RT a PRM Conductor lze škálovat na tisíce cílů v krátkých gradientech, což je výhodné pro verifikaci velkých kandidátních seznamů biomarkerů.
• Vysoká citlivost a přesnost: vhodné pro kvantifikaci nízkoabundantních biomarkerů ve složitých biologických matricích jako je plasma.
• Workflow vhodný pro translaci do klinických studií a laboratoří kvality, kde je potřeba kombinace rychlosti, reprodukovatelnosti a absolutní kvantifikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Predikované směry rozvoje a doporučené aplikace:

• Rozšíření na vyšší multiplex (tisíce cílů) s dalším vylepšením plánovacích algoritmů a pokračujícím laděním Adaptive RT.
• Integrace plně automatizovaných nástrojů pro návrh metod a filtrování výsledků, včetně zprovoznění PRM Conductor jako běžné součásti Skyline release.
• Validace workflow v širších klinických kohortách a jiných matricích (serum, CSF, tkáňové digesty) směřující k rutinnímu použití v klinické proteomice.
• Využití kombinace DIA a PRM pro hybridní strategie: rychlá průzkumná data (DIA) a následná cílená verifikace (PRM) s automatickým přenosem přechodů.
• Vývoj standardizovaných referenčních sad a kontrol pro lepší mezi-laboratorní porovnatelnost a masové nasazení.

Závěr

Ukázaný workflow na Stellar MS demonstruje, že moderní hardware ve spojení se softwarovými nástroji (Skyline + PRM Conductor) umožňuje rychlé, citlivé a vysoce multiplexní PRM assay pro plasmatické biomarkery. Metoda kombinuje vysokou produktivitu (14–24 min gradienty), attomolární senzitivitu a dobrou reprodukovatelnost, což otevírá nové možnosti pro škálovatelné biomarkerové verifikace v translaci a klinickém výzkumu.

Reference

1. Absolute Quantitation - PQ500: Panorama Public, Thermo Fisher Research and Development - PRM Conductor (2024).
2. Remes, P. M.; Jacob, C. C.; et al. Journal of Proteome Research 2024, 23(12), 5476–5486.
3. Varma, V. R.; Varma, S.; et al. Molecular Psychiatry 2017, 22(1), 13–23.
4. Chung, T.-J.; Hsu, K.-Y. Journal of Diabetes Investigation 2015, 7(2), 190–196.