Revolutionizing translational research: large-scale targeted PRM proteomics assays enabled by Stellar mass spectrometer

Význam tématu

Targeted PRM proteomika představuje klíčový nástroj pro ověřování biomarkerů v klinickém výzkumu a translational science. Moderní hmotnostní spektrometry s vysokou citlivostí a rychlostí akvizice umožňují analýzu stovek až tisíců peptidů v komplexních biologických matricích, jako je lidská plazma. Efektivita, reprodukovatelnost a nízké limity detekce jsou nezbytné pro spolehlivou kvantifikaci biomarkerů a podporu rozhodování v lékařském výzkumu a diagnostice.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit vysoce multiplexní PRM assay pro panel PQ500 referenčních peptidů v lidské plazmě za využití Thermo Scientific Stellar hmotnostního spektrometru a softwaru Skyline s externím nástrojem PRM Conductor. Studie porovnává dvě chromatografické metody s různou rychlostí skenování (60 SPD a 100 SPD) a ve třech pracovních krocích (unscheduled PRM, široko-okenní PRM, úzkookenní PRM) demonstruje kompletní workflow dokončené během 3–4 pracovních dnů.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace:

• Thermo Scientific Stellar MS s dynamicky řízenou dobou injekce a Adaptive RT real-time chromatogram alignment
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC s EASY-Spray HPLC ES906A kolonkou (trap-and-elute)
• Skyline software s externím nástrojem PRM Conductor
• PQ500 referenční peptidy (Biognosys AG) a trypticky štěpená lidská plazma (Thermo Scientific Pierce)

Metodika:

• Krok 1 – vytvoření Skyline dokumentu, spektrální knihovny a unscheduled PRM metod pro 804 PQ500 peptidů rozdělených do 10 frakcí
• Krok 2 – široko-okenní PRM akvizice na neat-peptidech a spike-in plazmě pro ověření retenční doby
• Krok 3 – filtrování prekurzorů a tranzicí v PRM Conductor podle S/N, plochy, RT, nabití; export úzkookenních PRM metod (0,6 min pro 60 SPD, 0,35 min pro 100 SPD)
• Akvizice dat pomocí 60 SPD (scan rate 125 kDa/s, HCD 30 %, m/z 200–1500) a 100 SPD (custom scan range)
• Analýza dat v Skyline: výpočet CV, LOD, LOQ a kalibračních křivek

Hlavní výsledky a diskuse

Pro konečné metody bylo zaznamenáno 1622 prekurzorů a cca 13 800 tranzicí pro obě gradientní rychlosti. Reproducibilita (n=10) dosáhla u 94 % peptidů CV <20 %. Lože kvantifikace (LOQ) většiny peptidů bylo <50 attomolů (85 % <500 attomolů) a limity detekce (LOD) téměř všechny <50 attomolů. Metoda 60 SPD vykázala o 1,6× nižší LOQ a LOD než 100 SPD. Detailní kalibrační křivka pro peptid ELLDTVTAPQK demonstrovala lineární odezvu v pracovním rozsahu.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutý workflow umožňuje:

• Rychlou tvorbu vysoce multiplexních PRM metod během několika dnů
• Analýzu stovek peptidů s vysokou citlivostí a přesností ve složitých matricích
• Automatizované filtrování tranzicí a adaptivní řízení akvizice pro optimální parametry
• Vysokou reprodukovatelnost a nízké limity detekce vhodné pro klinické ověřování biomarkerů

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry:

• Rozšíření panelů peptidů a aplikace na endogenní proteiny v klinických vzorcích
• Integrace s pokročilými softwarovými nástroji a machine learning pro automatizovanou selekci tranzicí
• Využití adaptivních chromatografických a akvizičních strategií pro vyšší multiplexaci a zkrácení analýz
• Implementace v regulovaných prostředích (QA/QC, farmaceutické laboratoře) pro validaci biomarkerů

Závěr

Studie demonstrovala, že kombinace Stellar MS, Vanquish Neo UHPLC, Skyline a PRM Conductor umožňuje efektivní vývoj a provoz cílených PRM assay pro velkoplošné kvantifikace peptidů v plazmě. Metody 60SPD i 100SPD dosahují vysoké citlivosti, reprodukovatelnosti a nízkých LOD/LOQ, přičemž 60SPD vykazuje mírně lepší výkon.

Reference

1. Philip M. Remes, Cristina C. Jacob et al. bioRxiv. 2024 Jun 1. doi:10.1101/2024.05.31.596848
2. PRM Conductor. Panorama Web (Thermo Fisher Scientific).