Unlocking biological insights with the Stellar mass spectrometer for Adaptive RT-enhanced quantitative proteomics for plasma biomarker analysis

Význam tématu

Rozvoj škálovatelných, multiplexních cílených proteomických metod pro kvantifikaci biomarkerů v lidské plazmě je klíčový pro přechod z objevné fáze do velkých klinických studií a rutinní laboratorní praxe. Schopnost spolehlivě monitorovat stovky až tisíce peptidů v krátkém čase s vysokou citlivostí a stabilitou retence zvyšuje průkaznost biomarkerů, zrychluje validaci a umožňuje longitudinální sledování nemocí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky bylo demonstrovat možnost vytvořit rozsáhlý multiplexovaný cílený PRM panel (804 cílených peptidů z Biognosys PQ500 sady) použitím Stellar hmotnostního spektrometru s funkcí Adaptive RT a volitelnou MS3 fragmentací. Metoda byla navržena pro rychlou (30 min gradient) a robustní kvantifikaci potenciálních plazmatických biomarkerů a ověřena na plazmových vzorcích od pacientů s plicním karcinomem, Alzheimerovou nemocí a kolorektálním karcinomem (CRC).

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Automatizovaná příprava vzorků pomocí AccelerOme platformy; standardy PQ500 jako těžké internalní standardy.
• Chromatografie: Vanquish Neo UHPLC, EASY-Spray column (2 µm C18, 150 µm × 15 cm), 30min gradient, kolona 55 °C, autosampler 7 °C.
• Sledování: plánovaný PRM panel v Skyline, export metody pomocí PRM Conductor, Adaptive RT (reálné časové zarovnání retenčních časů) s plánovaným oknem ~0.65 min.
• Akvizice: PRM (tMS2) a doplňkové MS3 pro snížení interferencí u nízce abundantních peptidů; optimalizace AGC, max. inj. času a HCD energie.
• Analýza dat: Skyline-daily pro kvantifikaci, kalibrace a porovnání mezi skupinami.

Použitá instrumentace:

• Stellar mass spectrometer (s lineárním iontovým pastí umožňující MS3).
• Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC System.
• Thermo Scientific Easy-Spray Source a EASY-Spray HPLC column (2 µm C18, 150 µm × 15 cm).
• Biognosys PQ500 Reference Peptide kit jako těžké standardy.
• Thermo Scientific AccelerOme Automated Sample Preparation Platform.
• Software: Skyline (v.24.1.1.398) a PRM Conductor pro tvorbu metod MS3.

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky:

• Byl vytvořen cílený panel pokrývající 804 peptidů, chromatograficky separovaných během 30 minut.
• Stabilita retenčního času byla vynikající: průměrné CV retenčních časů ~0,36 % (medián 0,35 %).
• Reprodukovatelnost: >94 % peptidů mělo CV < 25 % (n=7).
• Lineárnost: téměř 90 % peptidů vykázalo kalibrační křivku s R2 > 0,9.
• Citlivost: detekce peptidů v rozsahu nízkých attomolů; příklad LOQ 13,6 amol pro peptid AFQVWSDVTPLR.
• Ve vzorcích plazmy bylo pomocí cílených metod identifikováno 292 endogenních proteinů (472 peptidů) metodou MS2; kombinací MS2 a MS3 celkem 322 proteinů (507 peptidů), včetně 57 proteinů považovaných za FDA schválené biomarkery.
• MS3 zlepšilo poměr signál/šum a vedlo k ~10,3% zvýšení počtu identifikovaných proteinů u peptidů s interferencemi.
• Při použití 1 µg kolikony vzorku se počet detekovaných proteinů zvýšil o 73 % oproti 25 ng na column.
• V analýze CRC pacientů bylo nalezeno 29 proteinů statisticky signifikantně změněných (>2×, adj. p<0,05), včetně SAA2, A2GL a CO9, které korespondují s publikovanými nálezy.

Diskuse:
Adaptive RT umožňuje zúžení akvizičního okna na ~0,6–0,65 min, čímž se výrazně zvýší počet možných současně sledovaných cílů bez ztráty piků při proměnlivé chromatografii v dlouhých kohortních studiích. MS3 zase řeší problém matice a interferencí, což je klíčové pro nízce abundantní biomarkery v plazmě. Kombinace rychlé akvizice Stellar platformy a robustního plánování v Skyline umožnila vysokou propustnost a důslednou kvantifikaci napříč skupinami.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické výhody:

• Škálovatelnost: možnost rozšířit cílené assay na stovky až tisíce peptidů bez častého přeplánování retenčních časů.
• Vysoká citlivost a linearita umožňují měření biomarkerů v širokém koncentračním rozmezí (od pg/mL po µg/mL) v jediné analýze.
• Robustnost pro longitudinální a multi-centrové studie díky stabilním retenčním časům a Adaptive RT.
• MS3 vhodné pro potvrzování nízko abundantních či interferovaných signálů, zlepšuje důvěryhodnost kvantifikace pro klinické aplikace.
• Rychlost: 30min gradient umožňuje vysokou průchodnost vzorků při zachování rozlišení a citlivosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje:

• Další rozšiřování multiplexních panelů (tisíce peptidů) s optimalizovaným plánováním a automatizovanou validací.
• Integrace s robustními automatizovanými platformami pro přípravu vzorků a výpočtovými nástroji pro zvýšení throughputu a reproducibility.
• Standardizace a klinická validace panelů pro diagnostické/ prognostické použití a krok k regulované klinické diagnostice.
• Využití pokročilých algoritmů pro detekci a korekci interferencí, včetně strojového učení pro predikci chování peptidů v chromatografii.
• Propojení longitudinálních dat s klinickými end-pointy pro stratifikační biomarkery a monitorování odpovědi na terapii.

Závěr

Stellar mass spectrometer ve spojení s Adaptive RT a možností MS3 představuje výkonnou platformu pro velkoškálové cílené proteomické assay v plazmě. Metoda prokázala vysokou citlivost, reprodukovatelnost a schopnost kvantifikovat stovky peptidů během rychlého chromatografického běhu. Tyto vlastnosti ji činí vhodnou pro translaci objevů do klinických studií a pro provádění longitudinálních a vícestupňových biomarkerových studií.

Reference

1. Qingling Li, et al. TN003861: New paradigm for plasma proteomics biomarker research: large-scale targeted PRM proteomics assays enabled by Thermo Scientific Stellar mass spectrometer.
2. Qin Fu, et al. Development and Clinical Evaluation of a Multiplexed Health Surveillance Panel Using Ultra High-Throughput PRM-MS in an Inflammatory Bowel Disease Cohort. Angew Chem Int Ed Engl. 2025. doi:10.1002/anie.202507610.
3. Juthamard Chantaraamporn, et al. Glycoproteomic Analysis Reveals Aberrant Expression of Complement C9 and Fibronectin in the Plasma of Patients with Colorectal Cancer. Proteomes. 2020;8(3):26.
4. Bethany Geary, et al. Discovery and Evaluation of Protein Biomarkers as a Signature of Wellness in Late-Stage Cancer Patients in Early Phase Clinical Trials. Cancers. 2021;13(10):2443.
5. Tanja A. Davis, et al. Serum Amyloid A Promotes Inflammation-Associated Damage and Tumorigenesis in a Mouse Model of Colitis-Associated Cancer. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 2021;12(4):1329-1341.
6. du Plessis M, et al. A functional role for Serum Amyloid A in the molecular regulation of autophagy in breast cancer. Front Oncol. 2022;12:1000925.
7. James D. McFadyen, et al. Feasibility, Effectiveness and Safety of Elastomeric Pumps for Delivery of Antibiotics to Adult Hospital Inpatients-A Systematic Review. Front Immunol. 2018;9:1351.
8. A. Skesters, et al. Selenium, selenoprotein P, and oxidative stress levels in SARS-CoV-2 patients during illness and recovery. Inflammopharmacology. 2022;30:499-503.
9. Moeez Rathore, et al. Leucine-Rich Alpha-2-Glycoprotein 1 Promotes Metastatic Colorectal Cancer Growth Through Human Epidermal Growth Factor Receptor 3 Signaling. Gastroenterology. 2025;68(2):300-315.