Hybrid DIA on the Orbitrap Excedion Pro mass spectrometer: Bridging global depth and targeted sensitivity for proteomic analysis

Hybrid DIA na Orbitrap Excedion Pro: kombinace globální hloubky a cílené citlivosti pro proteomickou analýzu

Význam tématu

V proteomice existuje trvalý kompromis mezi širokým objevovacím pokrytím (data‑independent acquisition, DIA) a vysokou citlivostí a přesností kvantifikace nízkoabundantních cílů (parallel reaction monitoring, PRM). Hybridní DIA, která integruje prvky DIA a cíleného PRM (tMS2) v jednom měření, řeší potřebu simultánně provádět rozsáhlé profilování a spolehlivou kvantifikaci bez zdvojení odběru vzorku či instrumentálního času. To je klíčové pro vzácné nebo časově citlivé vzorky, klinické studie a rutinní QA/QC workflowy.

Cíle studie a přehled

Autoři rozvíjejí a hodnotí výkon hybridní DIA implementované na Orbitrap Excedion Pro Hybrid Mass Spectrometer s podporou adaptivního retenčního času (adaptive RT) a OptiSpray ion source. Cílem bylo prokázat, že jeden 35minutový běh může zajistit hluboké proteomické pokrytí současně s citlivou a přesnou kvantifikací cílených peptidů napříč širokým rozsahem hmotnosti vzorku (HeLa digest 0,5–500 ng) a spike‑in standardu (6×5 mix; 0,05–500 fmol; testované až do amol hladin).

Použitá metodika

Klíčové prvky experimentu:

• Vzorky: Thermo Pierce HeLa Protein Digest Standard v sedmiře koncentracích (0.5, 5, 50, 100, 500 ng) s konstantním přídavkem 6×5 Peptide Reference Mix (0.05–500 fmol).
• Chromatografie: OptiSpray μPAC Neo 50 cm cartridge (micro‑pillar array) na Thermo Vanquish Neo UHPLC; přímá injekce, gradient 35 min, kolona 75 µm i.d., teplota 50–60 °C.
• Hmotnostní spektrometrie: Orbitrap Excedion Pro MS s kombinovaným DIA + tMS2 (PRM) režimem a funkcí adaptive RT pro dynamické plánování oken.
• Dataové zpracování: Spectronaut 20.1 (directDIA) pro průřezová identifikace a kvantifikaci; Skyline‑Daily V25.1 pro analýzu PRM (y‑ion přechody).

Klíčové nastavení (souhrn)

• DIA full scan: Orbitrap rozlišení vysoké (typ. 60–120k), přizpůsobené rozsahy a dynamické okna; PRM: úzké izolační okno (0,7 m/z), vyšší akumulace iontů pro citlivost.
• Adaptive RT: použití .RTbin souboru generovaného z RT Full Scan pro posun a zúžení retenčních oken v reálném čase.

Hlavní výsledky a diskuse

Globální pokrytí a reprodukovatelnost

• Při 50 ng HeLa: >6 000 proteinových skupin (>6 400 při některých bodech) a >62 000 peptidů identifikovaných v jednom 35min běhu.
• Vysoká mezi‑replicátová shoda: 99 % překryv proteinů a 96 % překryv peptidů mezi třemi technickými replikami 50 ng.
• Rozsah detekovaných proteinových abundancí přesahuje 5 řádů velikosti.
• Střední CV pro peptidy <15 % napříč všemi testovanými koncentracemi; pro tři repliky 50 ng byl medián CV ~9.9 %.

Lineární kvantifikace a dynamický rozsah

• DIA data vykazovala pro ~370 proteinů lineární chování napříč všemi koncentracemi (R² >0.8); ~1 300 proteinů vykázalo linearitu v alespoň třech koncentracích (R² >0.8), což odpovídá ~20 % z celkově pozorovaných proteinů.
• Příklad lineární závislosti: protein A8MXV4 s R² ≈0.98.

Cílená kvantifikace (PRM) a citlivost

• 30 cílených peptidů z 6×5 mixu měřeno PRM se šesti odstupňovanými koncentracemi (0.05–500 fmol). Všechny peptidy vykázaly lineární kalibraci s R² >0.9.
• Limit quantifikace (LOQ) ~50 attomol a limit detekce (LOD) až kolem 5 attomol u některých peptidů; při nejnižších testovaných dávkách (5 amol) byly stále pozorovatelné signály.
• PRM poskytuje vyšší specificity a citlivost díky úzkým izolačním oknům a delším akumulačním časům; DIA je širší, ale může trpět sousedními prekurzory ve stejném m/z okně.
• Jeden hydrogenně extrémně hydrofilní peptid (VTSGSTSTSR) vykazoval odlišné chování a nižší linearitu, což připomíná, že vlastnosti jednotlivých peptidů (hydrofobita, retence) mohou ovlivnit metodu.

Přínosy a praktické využití metody

Hybridní DIA na Orbitrap Excedion Pro spojuje silné stránky discovery a cílených přístupů:

• Umožňuje hluboké profilování a současnou nízkoabundantní kvantifikaci v jednom běhu, čímž šetří vzorky a instrumentální čas.
• Vhodné pro omezené nebo cenné vzorky (klinika, biobanky, malý počet buněk), kde separátní měření nejsou praktická.
• Adaptive RT usnadňuje plánování širokého množství cílů s úzkými okny bez potřeby manuální optimalizace retenčních časů.
• OptiSpray + μPAC Neo cartridge přispívají k robustní, reprodukovatelné nano‑ESI a stabilní chromatografii, což podporuje konzistentní datovou kvalitu.

Použitá instrumentace

Hlavní hardware a spotřební materiál použitý v experimentu:

• Mass spectrometer: Thermo Scientific Orbitrap Excedion Pro MS.
• Ion source: Thermo Scientific OptiSpray Ion Source (automatizované umístění emitera, cartridge design).
• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC System.
• Kolony: OptiSpray μPAC Neo 50 cm cartridge (Thermo Scientific).
• Reagencie a spotřební materiál: LC‑MS grade voda a acetonitril s 0.1 % FA; DDM (n‑Dodecyl‑β‑D‑maltosid) pro resuspendování HeLa digestu; Promega 6×5 LC‑MS/MS Peptide Reference Mix.
• Software: Biognosys Spectronaut 20.1 (directDIA), Skyline‑Daily V25.1 pro PRM analýzy.

Diskuze technických aspektů

Hybridní přístup vyžaduje pečlivé nastavení: spojení DIA a tMS2/PRM vyžaduje správné plánování retenčních oken a vhodnou rovnováhu mezi šířkou izolačních oken a akumulačním časem. Adaptive RT (.RTbin) snižuje ruční kalibraci a umožňuje nasazení širších seznamů cílů. Nicméně celková citlivost a linearita mohou být ovlivněny matrikovými efekty a fyzikochemickými vlastnostmi konkrétních peptidů (např. extrémně hydrofilní sekvence).

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a aplikace hybridních přístupů:

• Rozšíření počtu měřených cílů díky vylepšenému RT managementu a rychlejším skenům; aplikace v multiplexovaných klinických panelech a routinní průmyslové kontrole.
• Integrace stabilně izotopově značených standardů (SIL) a automatizovaných pracovních postupů pro zlepšení přesnosti a standardizace v klinických laboratořích.
• Využití při nízkém odběru vzorku v single‑cell proteomice nebo pro longitudinalní studie s omezeným množstvím materiálu.
• Pokračující optimalizace softwaru pro hybridní datové zpracování (lepší dekonvoluce DIA signálů, automatická validace PRM přechodů, strojové učení pro adaptivní plánování měření).

Závěr

Teknická poznámka dokládá, že hybridní DIA na Orbitrap Excedion Pro s OptiSpray ion source a adaptive RT poskytuje prakticky použitelnou kombinaci širokého objevového pokrytí a vysoké citlivosti cílené kvantifikace v jediném 35min běhu. Metoda prokázala >6 000 proteinů při 50 ng HeLa, rozšířený dynamický rozsah (>5 řádů), dobrou reprodukovatelnost (medián CV <15 %) a PRM LOQ v attomolové oblasti (~50 amol). Hybridní přístup tak představuje atraktivní řešení pro studie vyžadující současně hluboké profilování a přesné kvantifikování nízkoabundantních analyů.

Reference

1. Martínez‑Val A., et al. Hybrid DIA: intelligent data acquisition integrates targeted and discovery proteomics to analyze phospho‑signaling in single spheroids. Nature Communications. 2023;14:3599.
2. Goetze S., et al. Simultaneous targeted and discovery‑driven clinical proteotyping using hybrid‑PRM/DIA. Clinical Proteomics. 2024;21:26.
3. Remes P., et al. Highly Multiplex Targeted Proteomics Enabled by Real‑Time Chromatographic Alignment. Analytical Chemistry. 2020;92:11809.