Unveil plasma proteomics with cutting-edge hybrid-DIA methods utilizing two strategies on the Orbitrap Astral Zoom MS

Hybrid-DIA pro plasmatickou proteomiku na Orbitrap Astral Zoom MS — shrnutí technické poznámky

Význam tématu

Plazma jako biologická matrice obsahuje hodnotné biomarkery, jejichž kvantitativní měření vyžaduje současně vysokou citlivost a široké proteomické pokrytí. Tradiční rozhodování mezi cílenou kvantifikací (PRM/SureQuant) a objevnou proteomikou (DIA) omezuje schopnost provádět paralelně robustní objevné studie a vysoce citlivá měření nízkoabundance peptidů. Hybrid‑DIA kombinuje oba přístupy tak, aby bylo možné současně dosahovat přesné kvantifikace vybraných peptidů a zachovat nezkreslené DIA pokrytí pro objev biomarkerů, což je zásadní pro translační výzkum a analýzy velkých souborů vzorků.

Cíle a přehled studie

• Cílem bylo vyvinout a porovnat dvě hybridní metody (tMS² hybrid‑DIA a SureQuant hybrid‑DIA) na Orbitrap Astral Zoom MS pro simultánní cílenou kvantifikaci a DIA objevnou analýzu plasmatických vzorků.
• Hodnocení zahrnovalo dopad počtu cílených peptidů (30–300), linearitu, LOD/LOQ, reprodukovatelnost a srovnání s klasickým DIA a standardními PRM/SureQuant workflow.
• Testovací materiál: PQ500 referenční peptidový mix (Biognosys) spike‑in do lidské nemodifikované plasmy, serialní ředění pro určení analytických parametrů.

Použitá metodika a instrumentace

• Hlavní instrumentace:
  • Thermo Scientific Orbitrap Astral Zoom Mass Spectrometer
  • Thermo Scientific Vanquish Neo UHPLC System s EASY‑Spray kolonkou (2 µm C18, 150 µm × 15 cm)
  • Thermo Scientific AccelerOme Automated Sample Preparation Platform
  • Thermo Scientific Easy‑Spray Source
• Materiály: PQ500 referenční peptidový kit, digesce plasmatu automatizovaným AccelerOme workflow, trap‑and‑elute injekční schéma, gradienty optimalizované pro 32 min běh.
• Hybridní strategie:
  • tMS² hybrid‑DIA: MS¹ → cílené MS² (PRM seznam bez těžkých standardů) → DIA; využívá plánované RT a adaptivní RT; izolace tMS² okna ~5 m/z.
  • SureQuant hybrid‑DIA: Survey Run pro charakterizaci těžkých peptidů → SureQuant založené on‑the‑fly triggerované PRM MS² pro těžké/lehká páry → DIA; používá těžké standardy a vyžaduje seznam přechodů.
• MS parametry: DIA rozsah 350–980 m/z, Astral detektor, krátké injekční časy pro DIA (max inj. čas 5 ms), MS¹ rozlišení 120–240k v závislosti na režimu; pro tMS² i SureQuant definované AGC, izolační šířky a RT okna (2 min).
• Analýza dat: převod DIA dat HTRMS konvertorem, library‑free directDIA vyhledávání ve Spectronaut (v20.1), zpracování cílených vzorků a kalibrací v Skyline (verze uvedena), statistika a křivky linearity v Pythonu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Identifikace proteinů a peptidů: Hybrid‑DIA si zachovala velkou část proteomické hloubky. tMS² hybrid‑DIA vykázala průměrné snížení počtu proteinových skupin o ~9.5% (692 → 593–645) a peptidových ID o ~4.2% oproti standardnímu DIA. SureQuant hybrid‑DIA mělo průměrné snížení proteinových skupin ~12.8% a peptidových ID ~6.7% (7,272 → 6,745–6,932).
• Data points per peak: Pro tMS² bylo průměrně 5.0–5.3 bodů/peak pro panely 30–120 peptidů, klesající na 4.5–4.7 při 200–300 peptidech. SureQuant hybrid‑DIA udrželo vyšší body/peak (průměrně 5.80 → 5.56 s rostoucím panelem), což ukazuje menší dopad na DIA akvizici.
• Reprodukovatelnost a korelace: Koeficienty variability (CV) proteinů i peptidů byly v přijatelné oblasti (protein CV zpravidla 3–7%, peptidové intenzity 8–13%), přičemž korelace proteinových kvantifikací mezi hybrid‑DIA a standardní DIA a mezi oběma hybridními přístupy byla velmi silná (Pearson r > 0.97). Korelace cílených peptidů s PRM/SureQuant byla rovněž vysoká (r až 0.994–0.999).
• Snížení intenzit cílených peptidů: Hybridní režimy vykázaly mírné snížení intenzit cílených peptidů oproti standardním PRM/SureQuant: ~10% pro tMS² hybrid‑DIA a ~13% pro SureQuant hybrid‑DIA. Toto snížení však zásadně neovlivnilo LOD/LOQ ani linearitu.
• Citlivost, linearita, LOD/LOQ: V testu 300 cílených peptidů mělo 89% R² > 0.99 a 99% R² > 0.90. Více než 92% peptidů mělo LOD < 25 amol a přes 82% LOQ < 50 amol na kolonku, což poukazuje na výjimečnou citlivost Orbitrap Astral Zoom MS při hybridních akvizicích.
• Rozsah detekce: Dynamický rozsah proteinových intenzit přesáhl 6 řádů v obou hybridních přístupech, což umožňuje sledování nízkoabundance biomarkerů současně s rozsáhlým objevem.

Přínosy a praktické využití metody

• Hybrid‑DIA umožňuje současně: 1) cílenou, vysoce citlivou kvantifikaci specifických peptidů (biomarkerů) a 2) objevnou DIA analýzu pro zjišťování nových kandidátů v tomtéž běhu, čímž šetří čas a vzorky v klinických studiích.
• tMS² hybrid‑DIA je jednodušší na nastavení, nepotřebuje těžké standardy a zajišťuje úplnost vrcholů a adaptivní RT, ale je náchylnější k interferencím bez potvrzení těžkými peptidy.
• SureQuant hybrid‑DIA poskytuje vyšší jistotu identifikace a více datových bodů pro cílené peptidy, avšak vyžaduje těžké standardy a složitější nastavení.
• Obě strategie jsou vhodné pro translační aplikace, screening velkých kohort a validaci biomarkerů v plasmatické proteomice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace hybrid‑DIA do klinických workflow: možnost zefektivnit biomarker pipelines tím, že v jednom běhu získáme jak kvantitativní údaje pro validované markery, tak i objevné informace pro nové kandidáty.
• Škálovatelnost: rozšíření panelů cílených peptidů a optimalizace počtu datových bodů/peak bude důležitá pro nasazení ve velkých kohortách; je třeba vyvážit velikost panelu a kvalitu PRM akvizice.
• Automatizace a standardizace: použití automatizovaných příprav (AccelerOme) společně s robustními standardy (PQ500 či vlastní těžké peptidy) umožní reprodukovatelné nasazení v regulovaných laborkách.
• Pokročilá datová analýza: vylepšení algoritmů pro extrakci hybridních dat, lepší handling interferencí a kombinace s machine learning pro prioritizaci kandidátů z DIA části jsou pravděpodobnými směry vývoje.

Závěr

Hybrid‑DIA na Orbitrap Astral Zoom MS, jak ve variantách tMS², tak SureQuant, nabízí životaschopný kompromis mezi citlivostí cílené kvantifikace a šíří objevné DIA analýzy. Obě metody udržují vysokou proteomickou hloubku, vykazují vynikající citlivost (LOD/LOQ v amol rozsahu), dobrou linearitu a reprodukovatelnost. Volba mezi tMS² a SureQuant závisí na potřebě těžkých standardů, počtu cílených peptidů a požadavcích na jistotu identifikace — každá varianta má své výhody pro konkrétní experimentální cíle v translační proteomice.

Reference

1. Martínez‑Val A. et al. Hybrid‑DIA: intelligent data acquisition integrates targeted and discovery proteomics to analyze phospho‑signaling in single spheroid. Nature Communications 2023, 14, 3599.
2. Gajadhar A. Thermo Fisher Scientific Technical Note 65873 — SureQuant intelligence‑driven MS: a new paradigm for targeted quantitation. Technical Note, Thermo Fisher Scientific.