Capture scheduled retention time window shift in large scale of peptide quantitation using a modified Orbitrap hybrid mass spectrometer

Význam tématu

Vysokokapacitní kvantifikace peptidů v proteomice je klíčová pro objevy biologických markerů a klinické aplikace. Přesné časování akvizice signálů v hmotnostní spektrometrii minimalizuje ztrátu detekovaných peptidů způsobenou posuny retenčního času v důsledku změn separačních podmínek (teplota kolony, průtok, výměna zařízení). Dynamická korekce retenčního času (adaptive RT) představuje inovativní přístup k automatickému nastavování úzkých oken akvizice v reálném čase, čímž zvyšuje pokrytí a reprodukovatelnost velkopanelových cílených metod.

Cíle a přehled studie

Autoři navrhli a optimalizovali adaptivní metodu plánovaných paralelních reakcí (PRM) pro kvantifikaci přibližně 800 standardních peptidů (PQ500) během 30minutového gradientu. Hlavním cílem bylo eliminovat chybějící hodnoty v důsledku posunů retenčního času a dosažení vysoké linearity, přesnosti a citlivosti bez nutnosti ručních úprav oken akvizice při změnách analytických podmínek.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci byl použit systém Vanquish Neo UHPLC s kolonkou EASY-Spray ES906 (75 µm × 150 mm) a lineárním gradientem kyseliny formiové v acetonitrilu. Spektrální akvizice probíhala na hybridním Orbitrap Excedion Pro MS s HCD fragmentací (30 % energií), izolačním oknem 4 m/z, rozlišením 15 000 a adaptivním plánováním oken.
Prvním krokem bylo získání referenčního .rtbin souboru z neschedulovaných plno­skenovaných dat peptidů v čistém roztoku. Na základě naměřených retenčních časů byla vytvořena metoda s 1,2minutovým oknem PRM. Následně se referenční data vložila do úzkého okna 0,6 minuty a spustila se konečná adaptivní PRM metoda obsahující tři experimenty: full-scan adaptive RT, full MS a plánovanou PRM akvizici.

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace adaptive RT prokázala schopnost automaticky posunout a rozšířit okna akvizice podle změn retenčního času při:

• změnách teploty kolony (40 → 50 °C),
• odlišném průtoku (0,8 → 1,0 µl/min),
• výměně analytické kolony.

Zatímco bez adaptivního plánu bylo zachyceno méně než 15 % peptidů, s adaptive RT se pokrytí zvýšilo na 90–94 %. Linearita kalibračních křivek ve vzorcích lidské plazmy vykazovala u >94 % peptidů R2 ≥ 0,9 a >98 % měly R2 ≥ 0,8. Opakovatelnost CV < 25 % byla dosažena pro >94 % peptidů (n=25 replik), detekční limity často pod 50 attomoly a kvantifikační limity kolem desítek attomolů.

Přínosy a praktické využití metody

Adaptive RT výrazně zjednodušuje rutinní nasazení rozsáhlých cílených PRM panelů tím, že odstraňuje potřebu manuálního přeladění retenčních oken při změnách provozních podmínek. To zvyšuje efektivitu laboratorních operací, zlepšuje kvalitu dat a umožňuje spolehlivou multiplexní kvantifikaci biomarkerů v klinickém a výzkumném prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším krokem je rozšíření adaptive RT na kvantifikaci posttranslačních modifikací, integrace s umělou inteligencí pro predikci posunů retenčního času a kombinace s orthogonalními separačními technikami. Technologie se může uplatnit i v oblasti metagenomiky proteomiky, environmentálních analýz a farmaceutického vývoje.

Závěr

Adaptive RT na Orbitrap Excedion Pro umožňuje robustní, vysoce propustné a reprodukovatelné měření stovek peptidů v krátkém gradientu bez ztráty dat při změnách separačních podmínek. Metoda kombinuje jednoduchou přípravu, automatické řízení oken akvizice a výborné analytické parametry, což ji předurčuje k širokému použití v proteomice a klinické analytice.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Thermo Scientific Vanquish Neo
• Kolonka: Thermo EASY-Spray ES906, 75 µm × 150 mm
• MS: Orbitrap Excedion Pro hybridní spektrometr
• Software: Skyline pro návrh a analýzu PRM dat

Reference

Li Q., Kellmann M., Deyarmin J., Samra S. Capture scheduled retention time window shift in large scale of peptide quantitation using a modified Orbitrap hybrid mass spectrometer. Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, 2025.