Next-generation immunopeptidomics with hybrid-DIA: Comprehensive identification and enhanced quantitative performance

Význam tématu

Imunopeptidomika mapuje peptidy prezentované molekulami MHC a je klíčová pro pochopení imunitního dohledu, identifikaci neoantigenů a vývoj imunoterapií. Zvýšení hloubky pokrytí a kvantitativní přesnosti této analýzy přímo ovlivňuje schopnost detekovat nízko-obiligátní, biologicky relevantní peptidy. Hybridní přístupy, kombinující data-independent acquisition (DIA) s cílenými skeny, nabízejí kompromis mezi rozsáhlým objevováním a citlivou kvantifikací, což je prakticky důležité pro preklinické i klinické aplikace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat výkon hybrid-DIA workflow na Orbitrap Astral Zoom MS ve spojení s Vanquish Neo UHPLC pro analýzu HLA třídy I peptidů. Studie porovnává klasické DIA a hybridní DIA (kombinace DIA pro objevování a cílených MS2 skenů pro zvýšenou citlivost) z hlediska pokrytí imunopeptidomu, dynamického rozsahu a kvantitativní přesnosti.

Použitá metodika a instrumentace

• Biologický materiál: HCT116 buňky, ošetřené (+/−) 10 ng/mL IFN-γ přes noc; zpracovány 10 milionů buněk na vzorek, výsledné naložení odpovídalo ekvivalentu 1×10^6 buněk.
• Izolace peptidů: Protokol Thermo Scientific Pierce MHC Class I Antibody Coupling Kit, W6/32 protilátka svázaná na Protein A/G magnetických perlách; inkubace lyzátu 2,5 h při 4 °C; eluace 1 % TFA, sušení a resuspendace v 0,1 % kyselině mravenčí.
• Chromatografie: Vanquish Neo UHPLC System; IonOpticks Aurora Ultimate 25×75 XT C18 kolona; Thermo EASY-Spray zdroj; doba běhu 72 minut.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific Orbitrap Astral Zoom MS s Astral analyzátorem; hybrid-DIA metoda integrující DIA skeny pro discovery a cílené MS2 (tMS2) pro zvýšenou citlivost.
• Datová analýza: Biognosys Spectronaut (včetně directDIA library-free přístupu), vyhledávání proti UniProt lidské databázi (20 607 sekvencí) s no-enzyme nastavením; Skyline pro extrakci a analýzu cílených peptidů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Pokrytí imunopeptidomu: Hybrid-DIA neposkytl kompromis v počtu identifikovaných peptidů v porovnání s klasickým DIA; průměrné počty identifikovaných peptidů byly velmi podobné (ukázkově ~23 473 pro DIA vs ~23 434 pro hybrid-DIA), přičemž byla vysoká míra překryvu mezi metodami.
• Kvantitativní linearita a citlivost: Všechny 20 cílených HLA-I peptidů vykázaly vysokou kvantitativní linearitu (R2 > 0,9); příklad kalibrační křivky pro peptid KIYEGQVEV měl R2 = 0,98. Korelace kvantifikací mezi DIA a hybrid-DIA byla silná (např. korelační koeficient R ≈ 0,927 mezi log10 množstvími).
• Dynamický rozsah a LOQ: Hybrid-DIA prokázal dynamický rozsah přes 5 řádů velikosti množství. Limit kvantifikace (LOQ) dosahoval na úrovni amol pro některé peptidy (LOQ < 10 amol; některé had hodnoty v intervalu 10–20 amol); v jednom případě byly v Skyline extrahovány signály při úrovních 1,5 amol a 1,1 fmol pro vybrané peptidy.
• Citlivost cílené analýzy: Vložené cílené MS2 skeny v hybridním režimu zvýšily citlivost měření bez negativního dopadu na celkové objevování peptidů, což umožnilo přesnou kvantifikaci od amol po fmol rozmezí.
• Data processing: Použitá library-free directDIA strategie ve Spectronautu umožnila vysokou míru identifikací bez potřeby předem připravené spektrální knihovny, což zvyšuje praktičnost workflow pro různé vzorky.

Přínosy a praktické využití metody

• Integrované řešení discovery + targeted: Hybrid-DIA umožňuje v jedné analýze současné získání širokého přehledu immunopeptidomu a vysoce citlivé kvantifikace předem definovaných peptidů, což šetří čas a materiál.
• Vhodné pro neoantigenovou a biomarkerovou identifikaci: Zvýšená citlivost a nízké LOQ podporují detekci nízkoabundantních antigenů relevantních pro imunoterapie a monitorování odpovědi na léčbu.
• Praktická implementace: Workflow kombinuje běžně dostupné nástroje (KingFisher automatizace, Vanquish Neo LC, Orbitrap Astral MS, Spectronaut, Skyline), usnadňuje zavedení v laboratorním prostředí a u standardizovaných platform v průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření automatizace a standardizace: Větší využití robotizovaných přípravných kroků a interních standardů (heavy-label peptidy) povede k lepší reprodukovatelnosti a rychlé adopci v klinickém prostředí.
• Vyšší propustnost a zkrácení analýz: Optimalizace LC gradientů a výkonnější analyzátory umožní zvýšit throughput bez ztráty citlivosti.
• Integrace pokročilé datové analýzy: Strojové učení a lepší FDR strategie pro immunopeptidomiku mohou zlepšit detekci vzácných peptidů a rozlišení izobarických signálů.
• Single-cell a nízkomateriálové přístupy: Další zlepšení citlivosti MS a miniaturizace přípravy vzorků mohou otevřít cestu k analýzám imunopeptidomu z velmi omezených klinických materiálů.
• Synergie s ortogonálními technologiemi: Kombinace s imunoassayemi, top-down proteomikou nebo prostorovou proteomikou může rozšířit biologický kontext prezentovaných peptidů.

Závěr

Hybrid-DIA na Orbitrap Astral Zoom MS ve spojení s Vanquish Neo UHPLC představuje robustní přístup pro imunopeptidomiku, který spojuje šíři identifikací typickou pro DIA s citlivostí a kvantitativní přesností cílených MS2 měření. Metoda dosahuje podobného pokrytí jako klasické DIA, přičemž přidává schopnost spolehlivé kvantifikace na amol–fmol úrovni a udržuje vysokou lineárnost a široký dynamický rozsah. To ji činí atraktivní volbou pro výzkum antigen presentation, neoantigen discovery a translational proteomiku.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Astral Zoom Mass Spectrometer (Thermo Scientific)
• Vanquish Neo UHPLC System (Thermo Scientific)
• IonOpticks Aurora Ultimate 25×75 XT C18 kolona
• Thermo EASY-Spray Source
• KingFisher Apex Purification System pro automatizaci imunoprecipitace
• Thermo Scientific Pierce MHC Class I Antibody Coupling Kit; W6/32 protilátka
• Softwarové nástroje: Spectronaut (directDIA / Spectronaut 20), Skyline

Reference

1. Salvato F., Li Q., Klenkle A., Patel B., Pekar Hart T. Next-generation immunopeptidomics with hybrid-DIA: Comprehensive identification and enhanced quantitative performance. Thermo Fisher Scientific whitepaper, 2026.
2. Spectronaut / directDIA (Biognosys) a Skyline (MacCoss Lab) použité jako analytické nástroje podle popisu v materiálu.