Characterization of Forced Degradation Impurities of Glucagon-Like Peptide-1 Agonists by LC/Q-TOF Mass Spectrometry

Význam tématu

GLP-1 agonisté představují klíčovou třídu bioterapeutik pro léčbu cukrovky a obezity. Peptidové léky jsou citlivé na chemické modifikace, které mohou ovlivnit jejich účinnost a bezpečnost. Studium nucené degradace umožňuje odhalit hlavní reakční cesty degradace a vyvinout robustní analytické postupy pro kontrolu kvality a validaci stability peptidů.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout a ukázat aplikaci LC/Q-TOF MS metody pro charakterizaci produktů nucené degradace tří GLP-1 agonistů: liraglutidu, semaglutidu a tirzepatidu. Studie se zaměřila na oxidativní stres s peroxidem vodíku a test deamidace při vysokém pH.

Použitá metodika

Vzorky peptidů byly připraveny v roztoku 30 % acetonitrilu a vystaveny H2O2 v koncentracích 0,05 – 2 % přes noc při rt pro oxidaci. Pro test deamidace byly vzorky inkubovány v Tris pufru pH 8,9 při 37 °C po dobu až 24 dnů. Chromatografie probíhala na kolonce Agilent AdvanceBio Peptide Mapping s 30minutovým gradientem. MS analýza byla provedena v pozitivním režimu ESI, rozsah 100–1700 m/z, rozlišení v dynamickém režimu 2 GHz.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC (G7120A, G7137A, G7116B)
• Agilent AdvanceBio Peptide Mapping kolonka (2.1×150 mm, 2.7 μm, 120 Å)
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF (G6549AA)
• Software Agilent MassHunter Data Acquisition v11.0
• Software Agilent MassHunter BioConfirm v12.1

Hlavní výsledky a diskuse

Oxidační stres vedl k tvorbě mono-, di- a tri-oxidovaných forem peptidů. Nejčastější modifikací byla oxidace zbytku tryptofanu, identifikovaná hromadným posunem +16 Da na 4+, 5+ a 6+ iontových stavech a potvrzená dekonvolucí spekter. Reversed-phase chromatografie umožnila částečné rozdělení izomerů oxidovaných forem. MS/MS spektra potvrdila lokalizaci oxidace na zbytku tryptofanu. Deamidace glutaminu při pH 8,9 byla zjištěna jako pomalý proces a po 24 dnech nebyly detekovány žádné adiční produkty.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí citlivou a spolehlivou platformu pro rutinní kontrolu kvality peptidických léčiv ve vývoji i výrobě. Integrovaná softwareová řešení umožňují automatizovanou dekonvoluci a potvrzení struktur degradačních produktů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření stresových studií o fotochemické a termické podmínky
• Aplikace na nově vznikající peptidické a proteinové terapie
• Využití pokročilé separační techniky pro lepší rozlišení izomerů
• Implementace strojového učení pro automatizovanou interpretaci dat

Závěr

Popsaná LC/Q-TOF MS metoda prokázala vysokou efektivitu při charakterizaci nucené degradace GLP-1 agonistů. Poskytuje solidní nástroj pro vývoj, validaci stability a kontrolu kvality peptidických bioterapeutik.

Reference

• Müller TD et al. Mol Metab. 2019;30:72-130.
• Kiese S, Pappenberger A, Friess W, Mahler HS. J Pharm Sci. 2008;97(10):4347-4366.
• ICH Expert Working Group. ICH Q5C. 1995.
• Bellmaine S, Schnellbaecher A, Zimmer A. Free Radic Biol Med. 2020;160:696-718.